原儿茶酸对Aβ1-42寡聚体诱导AD海马神经元的保护作用

李智勇，罗 汉，张海英

（1.海口市人民医院神经外科，海南 海口 570208；2.海南医学院人体解剖学教研室，海南 海口 571101）

·论 著·

原儿茶酸对Aβ1-42寡聚体诱导AD海马神经元的保护作用

李智勇1，罗 汉1，张海英2

（1.海口市人民医院神经外科，海南 海口 570208；2.海南医学院人体解剖学教研室，海南 海口 571101）

目的 应用Aβ1-42寡聚体诱导SD胎鼠海马神经元制备细胞损伤模型，观察海南益智仁提取物-原儿茶酸(PCA)对模型细胞的保护作用。方法采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活力，流式细胞技术检测细胞凋亡，蛋白质印迹法(Western blot)检测ERK蛋白，观察原儿茶酸对模型细胞的保护作用。结果Aβ1-42寡聚体干预SD胎鼠海马神经元后,神经元生存率下降，神经元凋亡率升高，ERK蛋白表达下调。添加原儿茶酸后，模型细胞存活率改善明显、凋亡率显著性降低，且呈现浓度依赖性，并且ERK蛋白表达上调。结论原儿茶酸可拮抗Aβ1-42寡聚体所诱导的海马神经元损伤，具有神经保护作用。

阿尔茨海默病；Aβ1-42寡聚体；原儿茶酸；ERK信号通路

阿尔茨海默病(AD)的防治具有积极的社会意义，中医药在AD防治中具有独到的地位和广阔的前景。研究发现，益智仁提取物-原儿茶酸(Protocatechuic acid，PCA)为天然酚酸类化合物，是益智仁的有效活性成分，具有良好的抗氧化作用[1]。前期研究发现，PCA对的缺血、缺氧神经元具有一定的保护作用[2]。本实验以Aβ寡聚体诱导AD神经元损伤模型，观察原儿茶酸对AD海马神经元损伤的保护作用，探讨可能的作用机制，找到AD防治的新途径和新策略，为进一步开发南药益智仁新的药用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 益智仁提取物-原儿茶酸由海南医学院实验室分离、纯化，经HPLC检测，纯度不低于98%，兔抗鼠ERK多克隆抗体购自美国Bioworld公司，Aβ1-42购自sigma公司，JC-1 Kit购自Molecular Probe公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞模型的制备及分组 Aβ1-42溶于预冷的六氟异丙醇中，室温孵育1 h，使之单体化，随后蒸发六氟异丙醇，残留的肽置于-80°C冰箱，随后溶于无水的二甲基亚砜中，浓度为5 mmol/L，与F12混匀，浓度为100 μmol/L，置4℃～8℃老化24 h，14 000×g离心10 min，可溶的Aβ寡聚体浮于上层，吸取上层液体，稀释后用以实验。1只SD大鼠孕(18±2)d，取胎鼠海马神经元培养14 d后，添加Aβ1-42寡聚体10 μmol/L干预24 h造模。实验分为五组：空白组(CTL)，空白组加入含10%胎牛血清的DMEM维持液；Aβ1-42模型组(Aβ1-42)；PCA组(3亚组浓度分别为：Aβ1-4210 μmol/L+PCA 0.1 μmol/L(PCA1组)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 1.0 μmol/L (PCA 2组)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 10 μmol/L(PCA 3组)，先给予PCA 0.5后，再添加Aβ1-42oligomer继续培养24 h，检测各项指标。

1.2.2 PCA对细胞模型活力的影响 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)实验，海马神经元以5×105/ml植入96孔板，根据实验分组分别加入干预因素，置CO2孵箱8 h、12 h、24 h后，各孔加入10 μl MTT，培养4 h后，去除培养液，添加200 μl二甲基亚枫，颗粒溶解后使用酶标仪，在490 nm的吸光值下，检测各组的吸光度。

1.2.3 流式细胞仪分析 实验各组干预24 h后，收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次，重新悬浮细胞至1×106/L，取100 μl细胞液，添加5 μl异硫氰酸荧光素标记的Annexin V和10 μl碘化丙锭混匀。置室温，避光静置15 min，各管加入400 μl结合缓冲液，1 h内进行流式细胞分析。激发波长为488 nm，计数104个细胞。所有数据均经Cell Qust软件收集处理。

1.2.4 Western blot检测 实验各组干预24 h后，收集细胞，PBS清洗3次，100 mm培养皿内加200µl细胞裂解液，置于冰上裂解20 min，15 000 r，4℃离心10 min，取上清液，蛋白定量。以10%SDS电泳分离，半干电转至NC膜，室温封闭2 h后，加入一抗ERK多克隆抗体，1:500稀释；4℃过夜，抗羊IgG二抗(1:1 000稀释)反应2 h，实验重复3次，GAPDH为内参照。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，参数值以均值±标准差(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCA对实验各组细胞活力的影响 采用MTT检测PCA对实验各组细胞的影响，发现PCA对Aβ1-42模型组细胞损伤具有保护作用。Aβ1-42模型组与PCA组相比较，A值差异具有统计学意义(P＜0.05)，细胞活力随PCA浓度的升高有所改善，呈一定的浓度依赖关系(量效关系)，见表1。

表1 各实验组对模型细胞存活率的影响(±s，n=6次)

表1 各实验组对模型细胞存活率的影响(±s，n=6次)

注：与对照组比较，aP＜0.01。

组别 吸光值(A490) 8 h 12 h 24 h Aβ1-42模型组PCA1组PCA2组PCA3组F值P值0.532±0.013 0.647±0.012a0.681±0.038a0.717±0.016a67.34 0.000 0.496±0.021 0.653±0.016a0.705±0.042a0.734±0.039a91.93 0.000 0.464±0.017 0.671±0.024a0.726±0.039a0.723±0.048a147.66 0.000

2.2 PCA对细胞模型凋亡的影响 采用流式细胞技术检测PCA对模型细胞凋亡的影响，结果显示，Aβ1-42模型组凋亡率明显上升，与PCA组相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05，见图1)。

图1 PCA对细胞模型凋亡的保护作用

2.3 PCA对ERK蛋白表达的影响 采用Western blot检测PCA对ERK蛋白表达的影响，结果显示，Aβ1-42模型组ERK蛋白表达下调，PCA各实验组ERK蛋白表达上调。

图2 PCA对ERK蛋白表达的影响

3 讨 论

当前，我国人口进入老龄化阶段，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的发病率呈逐年上升趋势。AD的发病机理很复杂，其中Aβ(β-amyloid protein)级联学说认为，淀粉前体样蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的酶切代谢产物Aβ在AD发病早期起主要的作用。本实验结果发现，Aβ1-42寡聚体致使海马神经元活力下降，神经元凋亡增加，ERK表达下降，而原儿茶酸可以有效的改善海马神经元的活力，减少神经元凋亡，增加ERK表达。由此可以说明，原儿茶酸对Aβ1-42寡聚体损伤的海马神经元具有一定保护作用。

细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated kinase，ERK)参与细胞凋亡信号途径的一类信号分子，与AD的发病机制相关，与海马区学习记忆功能有密切联系[3]。ERK属于一类丝/苏氨酸蛋白激酶，是有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族的一个重要成员，ERKl、 ERK2分子量分别为44 kD和42 kD。MEK(MAP kinase kinase)为MAP2K家族成员，有MEK1和MEK2两种亚型，分子质量分别为44 kD和45 kD，通过磷酸化酪氨酸/苏氨酸(Tyr/Thr)残基，进而激活下游底物ERK1/2。ERK下游的MAPKAPK主要是90 kD核糖体S6激酶，转位进入细胞核并磷酸化一系列底物，如c-Fos、帽结合蛋白(Cap binding protein，CBP)等[4]。有研究发现，神经元损伤发生后，ERK在神经损伤的区域激活，减少细胞凋亡，从而缩小创伤范围，降低对机体的影响[5]。本研究结果显示Aβ1-42寡聚体可以增加海马神经元的凋亡率。分子生物学机制的研究结果表明，加入Aβ1-42寡聚体24 h后，海马神经元ERK蛋白表达水平下降；给予原儿茶酸干预后，ERK蛋白表达水平升高。结果提示，Aβ1-42寡聚体可造成海马神经元的损伤，而神经元损伤的机制可能与ERK信号通路有关，并且原儿茶酸的神经保护作用可能参与ERK蛋白的表达。

综上所述，原儿茶酸对Aβ1-42寡聚体诱导的海马神经元损伤具有保护作用，且原儿茶酸的药物作用机制与ERK信号转导途径有关。因此，益智仁提取物-原儿茶酸在AD治疗中具有一定的潜在应用价值，但其作用机制还需要进一步的深入研究。

[1]Zhang X,Shi GF,Liu XZ,et al.Anti-ageing effects of protocatechuic acid from Alpinia on spleen and liver antioxidative system of senescent mice[J].Cell Biochem Funct,2011,29(4):342-347.

[2]李智勇,夏 鹰,陈晓东,等.益智仁提取物原儿茶酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].海南医学,2013,24(2): 157-159.

[3]吴 哲,赵艳华,彭 博,等.碱性成纤维细胞生长因子对AD细胞模型ERK1/2活性的影响[J].解剖科学进展,2011,17(3): 300-303.

[4]赵明哲,刘靖华,李玉花,等.ERK信号通路的信号转导调控机制[J].国际病理科学与临床杂志,2009,29(1):15-19.

[5]陶 昕,孟祥志,孙 丽,等.MAPK信号通路与神经系统损伤的研究进展[J].解剖科学进展,2010,16(6):574-577,582.

Protective effect of protocatechuic acid on AD hippocampl neurons treated with Aβ1-42oligomer.

LI Zhi-yong1, LUO Han1,ZHANG Hai-ying2.1.Department of Neurosurgery,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan, CHINA;2.Department of Anatomy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of protocatechuic acid(PCA)fromAlpinia oxyphyllain Hainan on nerve cell injury models,which were established by incubating hippocampl neurons of SD fetal rats in the presence ofβ-amyloid 1-42(Aβ1-42)oligomer.MethodsWith cell viability detected by MTT,apoptosis detected by flow cytometry and ERK protein detected by Western blot,the protective effect of PCA on nerve cell injury models was observed.ResultsAfter intervention by Aβ1-42oligomer.the viability of hippocampl neurons were decreased;The apoptotic rate increased;ERK protein expression was down-regulated.However,after the addition of PCA,the viability of hippocampl neurons significantly improved and the apoptotic rate significantly reduced,with dose-dependent effect.The expression of ERK protein was also up-regulated.ConclusionPCA had a significant protective effect against Aβ1-42oligomer-induced injury.

Alzheimer's disease;Aβ1-42oligomer;Protocatechuic acid(PCA);ERK signal pathway

R-332

A

1003—6350（2015）14—2029—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0735

2015-01-12)

国家自然科学基金(编号：81100246)；海南省自然科学基金(编号：811204)；海口市重点科技计划项目(编号：2011-0135)

张海英。E-mail：hyzhang_xjtu@yahoo.cn