铁皮石斛组培苗生根条件优化研究

彭文书+马莉+赵苗苗+张文杰+严亮

摘 要 以铁皮石斛无菌幼苗为材料，在不同生根培养基中添加不同配比的生长调节物质、香蕉汁、马铃薯汁以及活性炭，研究其对铁皮石斛组培苗生根效果的影响。研究结果表明，生根培养基为：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+10.0%香蕉汁+10.0%马铃薯汁+NAA 0.4 mg/L+2.0%蔗糖+0.04%活性炭，生根条件为光照强度2 000 lx、琼脂用量7.0 g/L、培养基pH为5.8是最适宜条件。

关键词 铁皮石斛 ；组培苗 ；生根条件 ；优化

分类号 S567.23+9

铁皮石斛（Dendrobium officinale） 为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium sw.）植物，是一种十分珍贵的中药材植物，主要分布于我国云南、广西、广东、贵州等南方省区[1]。铁皮石斛是《中华人民共和国药典》收录的5种石斛属植物之一[2]。铁皮石斛具有较高的药用价值，《中国药学大词典》称其具有“滋养阴津”功效，清代《药性论》说石斛能补肾积精、养胃阴、益气力和增强体质。石斛作为益胃生津药在《神农本草经》、《本草再新》中均有记载[3]。现代医学对铁皮石斛的研究表明，多糖是一种有价值的中药类免疫增强剂。药理学研究表明，铁皮石斛的多糖、氨基酸、生物碱等成分，具有提高免疫功能、抗氧化、抑制肿瘤和降低血糖等作用[4-9]。但由于铁皮石斛生长条件十分苛刻，自然产量极少，加上生态破坏和药农的过度采挖，致使铁皮石斛野生资源的有些品种已面临灭绝的境地。野生石斛在自然条件下的繁殖率很低，林下移栽种植铁皮石斛成活的关键因素却是组培苗的生根壮苗，因此在组织培养过程中提高组培苗生根率尤为重要。

本文选择生长一致的的铁皮石斛组培瓶幼苗，研究不同生长调节物质浓度、不同添加物及浓度对铁皮石斛生根和生长的影响，以确定适合铁皮石斛壮苗生根最适宜的培养基，提高林下移栽铁皮石斛组培苗的成活率。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛无菌试管幼苗由普洱茶研究院民族药膳实验室购进，选取3～4 cm无根或少量细根的铁皮石斛无菌试管幼苗为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 培养条件

培养室温度26℃，湿度50%～60%，光照强度2 000 lx，每天光照12 h，培养基pH为5.8。

1.2.2 试验方法

在无菌条件下将材料取出，分别接种到所配制的生根壮苗培养基中。生根壮苗培养基设5个变量，分别是：6-BA、NAA、香蕉汁、马铃薯汁和活性炭。香蕉汁的制作方法是先按比例称取香蕉之后打成汁，而马铃薯汁是先按比例称取马铃薯后用水煮沸过滤出汁。每个处理培养基在1/2 MS基础中均加入20 g/L蔗糖、7 g/L琼脂，每处理接种10瓶，每瓶接种5株。培养1周后观察统计幼苗的成活情况，并进行测量计算生根率、生根数、根长和苗高，取其平均值进行数据比较，分析不同培养基对铁皮石斛生长情况的影响。

基本培养基均为1/2MS。

1.2.2.1 不同浓度6-BA对铁皮石斛的生根生长的影响

变量6-BA的量为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L。

培养基其他添加物为香蕉汁6.0%+马铃薯汁6.0%+活性炭0.2%+琼脂7.0 g/L+蔗糖2.0%。

生长调节物质NAA 0.2 mg/L。

编号分别为S1，S2，S3，S4。

1.2.2.2 不同浓度NAA对铁皮石斛的生根生长的影响

变量NAA的量为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L。

培养基其他添加物为：香蕉汁6.0%+马铃薯汁6.0%+活性炭0.2%+琼脂7.0 g/L+蔗糖2.0%。

生长调节物质6-BA0.3 mg/L。

编号分别为S5，S6，S7，S8。

1.2.2.3 不同浓度香蕉汁对铁皮石斛的生根生长的影响

变量香蕉汁的比例为6.0%，8.0%，10.0%，12.0%。

培养基其他添加物马铃薯汁6.0%+蔗糖2.0%+活性炭0.2%+琼脂7.0g/L。

生长调节物质NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

编号分别为S9，S10，S11，S12。

1.2.2.4 不同浓度马铃薯汁对铁皮石斛的生根生长的影响

变量马铃薯汁的比例为6.0%，8.0%，10.0%，12.0%。

培养基其他添加物香蕉汁10.0%+蔗糖2.0%+活性炭0.2%+琼脂7.0g/L。

生长调节物质NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

编号分别为S13，S14，S15，S16。

1.2.2.5 不同浓度活性炭对铁皮石斛的生根生长的影响

变量活性炭的量为0.0%，0.1%，0.2%，0.4%。

培养基其他添加物马铃薯汁10.0%+香蕉汁10.0%+蔗糖2.0%+琼脂7.0 g/L。

生长调节物质NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

编号分别为S17，S18，S19，S20。

1.2.3 数据处理

用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，同时采用LSD法进行两两比较，以P<0.005为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节物质组合对生长的影响

为研究不同添加物对石解试管苗壮苗和生根的影响，以l/2 MS为基本培养基。

2.1.1 不同浓度6-BA对铁皮石斛的生根生长的影响

实验结果（表1，图1）表明：接种后S3出根时间最短33.5 d，转接的组培苗开始长出新根；S1小苗生长整齐但苗分化较少，有原球茎增殖，叶片绿，根系欠发达；S2和S3二者效果都差别不大，区别在于S3分苗最多，为5.11株，植株的茎粗和叶片数达2.41 cm和9.08片；S4叶片黄，根系少且短，节间有膨大并有不定芽长出。由此可见，细胞分裂素6-BA的浓度过高或者过低，均不利于石斛组培苗的生长，当6-BA浓度为0.3 mg/L时，对根的诱导效果最佳。在6-BA浓度为0.4 mg/L时，不定芽的形成有促进作用。6-BA的浓度越小越倾向于原球茎的增殖，而随着其浓度的升高，不定芽的分化率也随之升高。这与6-BA具有诱导芽的分化促进侧芽萌发生长促进细胞分裂与扩大和高浓度抑制根的分化的作用相一致。

2.1.2 不同浓度的NAA对铁皮石斛的生根生长的影响

生长调节物质NAA对铁皮石斛生根的诱导率也有所不同（表2，图2）。当NAA为0.2 g/L时，生根最少，平均根数为6.82条，苗长势慢；NAA浓度为0.4 mg/L时，生根数8.06条，苗生长较快；NAA浓度增至0.6 mg/L时，生根数为8.79条，且苗长势较快，叶肥绿；当其浓度增加到0.8 mg/L时，其生根数降为5.45条。随着NAA浓度的升高对根的诱导反而下降，且生长一段时间后苗会枯黄并且有死亡出现，打开瓶盖可闻见酸臭味，测得培养基的pH<4.3，所以NAA浓度太高，不适宜铁皮石斛试管苗的生长。故本处理确定NAA 0.6 mg/L为最适宜浓度，生根诱导率最高，对石斛芽苗和茎的生长均有促进作用。

2.2 不同浓度的香蕉汁对铁皮石斛的生根生长的影响

随着香蕉汁比例发生变化，石斛丛生芽的生长时间缩短，并且根的数目也有所增多（表3，图3）。香蕉汁比例为6.0%和8.0%的培养基都可以满足石斛苗的正常生长，叶色正常，节间茎粗壮，根系较好，原球茎增殖较少；香蕉汁比例为10.0%的培养基生长速度与6.0%和8.0%相比有显著差异，叶色浓绿，根系发达，茎粗壮；香蕉汁比例为12.0%的培养基产生较多的原球茎并分化出小苗。由于香蕉汁中含有丰富的糖类和有机质，可为植物组织细胞分裂分化提供能源，并且，香蕉汁中含有植物生长调节物质，如细胞分裂素、生长素、乙烯和赤霉素等。所以，在石斛培养基中添加比例为10.0%的香蕉汁，对石斛的生长促近作用最大。

2.3 不同浓度的马铃薯汁对铁皮石斛的生根生长的影响

马铃薯汁对苗根的生长也起到了一定的作用。在马铃薯汁比例为6.0%的培养基中，石斛苗的株高、茎粗、叶片数明显不如马铃薯汁比例为8.0%和10.0%时的培养基，且根系欠发达（表4，图4）。而马铃薯汁比例为12.0%的培养基则对石斛苗的生长产生了明显的抑制作用，生长情况反而不如比例为8.0%和10.0%好，苗弱，根系发达但纤细，有大量的原球茎产生。因此，马铃薯汁的比例为8.0%最好。在进行石斛原球茎增殖时则可以把马铃薯汁比例提高到12.0%对于诱导原球茎有利。在马铃薯汁比例为10.0%时，苗高为6.52 cm，茎粗为2.43 cm，叶色浓绿或淡绿，叶片数增加到6.54片，每株苗根数增多为8.04条。马铃薯汁的作用方式有可能与香蕉汁相同，都能促进石斛生长。

2.4 活性炭对铁皮石斛的生根生长的影响

活性炭的添加对石斛苗生根和长势均有促进作用（表5，图5）。活性炭浓度从0.0%增至0.04%时，生根率从25%增至100%，平均根数从1.49条增至8.96条，且S19苗长势显著快于S20。因此，本处理确定0.4%活性炭更有利于石斛苗的生根和生长。

3 讨论与结论

前人研究的影响铁皮石解组织培养因素的结果表明，以生长调节物质添加培养基而言，6-BA对石斛试管苗生根具有促进作用，这与陈兆贵等[10]的结论相似。汪杰、蒋林和蒋向辉等[11-13]研究认为，附加物中含有各种天然营养成分及各种植物生长调节物质；李小军和Huang等[14-15]认为，经马铃薯汁、香蕉汁培养的铁皮石斛组培苗生长健壮，对生根壮苗较为有利。本试验结果也证实了这一点，但本试验在使用附加物的种类和浓度与前人有所不同。

在前人研究的基础上，本实验在使用生长调节物质浓度和附加物的种类与前人有所不同，进一步寻找生根壮苗的最优培养基配比的实验。结果表明，生长至3 cm以上的铁皮石斛组培苗在以生根培养基为：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+10%香蕉汁+10%马铃薯汁+NAA 0.4 mg/L+2%蔗糖+0.04%活性炭，光照强度为2 000 lx、琼脂用量7.0 g/L、pH 5.8的条件下培养60 d后苗高最高可达7～8 cm、茎粗可达1～2 cm、根长可达5～7 cm，足够达到出瓶的要求。另外，在试验中还新发现，当选用初始材料时，带些许短细根的初始材料，无论是长势还是生根情况，都要优于无根的试管苗。本实验对现有的石斛组培育苗技术进行改进，优选组培适宜林下仿生种植的石斛品种，为石斛仿生种植规模化推广示范种植提供技术支撑。

参考文献

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