三种简易菌种保藏方法的效果比较

张丽娜 舒东娇 刘莉莉 马玥 曹子晶

(哈尔滨市疾病预防控制中心 黑龙江 哈尔滨 150056)

菌种保藏方法有很多种，实验室常规采用的方法普遍存在保存时间短、需频繁传代等缺点，若要实现长期保存，则需购置专用设备，费用较高，且操作较复杂，不利于广泛应用。为能建立一种操作简便、保存时间长、菌种稳定性好的保藏方法，本文对三种简便的菌种保藏方法进行了比较性研究。

1.材料与方法

1.1 菌株

标准菌株大肠埃希菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌15442、产气肠杆菌45102、铜绿假单胞菌10104、伤寒沙门菌50071、福氏志贺菌51573、宋内志贺菌51334、溶血性链球菌32210 购自军事医学科学院。标准菌株大肠埃希菌25922、金黄色葡萄球菌26003、表皮葡萄球菌26069、粪肠球菌ATCC29212、溶血性链球菌CICC10373，购自广东环凯微生物有限公司。

1.2 保藏方法

1.2.1 鲜牛奶法

将鲜牛奶500 mL，煮沸后静置冷却，除去上层脂肪，反复3 次，然后用脱脂棉反复3 次过滤后，115℃，15 min 压力蒸气灭菌后分装于无菌2 mL 塑料离心管中，每管1 mL ，质控合格后备用［1］。将需保存的菌种37℃培养18 h 后，大量接种于此管中制备成浓菌液，置于普通冰箱的－20℃冷冻室保存。定期将保存菌株取出接种增菌肉汤中，35 ℃孵育18～24h ，再将菌悬液划线接种血琼脂培养基，观察菌株的存活情况及其菌落特征，并检验其生化特性。

1.2.2 滤纸片法

用打孔器将新华滤纸制成直径6 mm 圆形小纸片，放入玻璃平皿中，经高压蒸汽灭菌后备用。将待保存菌种在血平板上大量分离纯化后，用无菌小镊子夹住滤纸片，在平板上刮取菌落，放入无菌塑料离心管，封口后置于普通冰箱的－20 ℃冷冻室保存［2］。定期将保存菌株取出1－2片，放入增菌肉汤中，35 ℃孵育18～24h ，再将菌悬液液划线接种血琼脂培养基，观察菌株的存活情况及其菌落特征，并检验其生化特性。

1.2.3 商品化菌种保藏管

根据使用说明书将需保存的菌种37 ℃培养18 h 后在CRYOBANK 菌种保藏管中制备成菌悬液，颠倒混匀，置于普通冰箱的－20 ℃冷冻室保存。定期取一粒小珠滚动接种于血琼脂培养基，35 ℃孵育18～24h ，观察菌株的存活情况及其菌落特征，并检验其生化特性。

1.3 菌株复苏及鉴定

将全部菌株于保存后第3、6、9、12 个月进行菌种复苏，观察菌株污染情况以及菌落特征及镜下形态以及溶血性、抗原凝集特性等特征，根据《常见细菌鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定特征性生化反应，与保存之前进行比较验证保存效果。并采用梅里埃API20E、API20NE 及API20S 生化鉴定系统进一步复核鉴定，判断菌种保藏质量。

2.结果

于保存后第3、6、9、12月将各菌株复苏并进行生化鉴定，各存活菌株的生化鉴定结果均与保藏前一致，详见表1。

表1 三种保藏方法菌株存活情况

3.讨论

菌种是一种重要的生物资源，成功进行菌种保藏对于菌株的分子生物学特征研究和耐药性变迁监测，以及医院感染病原学调查、新药研究等至关重要，也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础［3］。

常规的菌种保存方法主要有冷冻真空干燥法和半固体培养基保存法，由于冷冻真空干燥法保存菌株存活率虽高，但操作繁琐、费时费力、成本高，给实际工作带来诸多不便，而半固体培养基保存法虽操作简单但具有保存期短、占用空间大、需反复传代易导致细菌发生变异等缺点，因此寻找一种简便、经济的菌种保存方法十分必要。

通过三种保藏方法的结果比较，苛氧菌的长期保存应选用CRYOBANK 菌种保藏管或鲜牛奶法，苛氧菌的短期保存及非苛氧菌的保存采用三种方法效果一致。三种保藏方法都具有操作简单、不需特殊设备、保存空间小等优点，但CRYOBANK 菌种保藏管造价高，而鲜牛奶法和滤纸片法具有取材方便、操作简单、成本低廉的特点，从经济实用的角度出发，尤其适合于基层实验室，具有推广应用价值。

［1］ 徐雅娟，陈森洲，袁桂峰，骆耐香，刘菁，钟毓娟.介绍一种新鲜牛奶保存菌种的好方法［J］.中国现代医学杂志，2002，20(1):139－141.

［2］ 郭志勤.介绍一种简易的菌种保存方法［J］.临床检验杂志，2002，20(5):281.

［3］ 张爱梅，郭大城，王建丽，张保华，陈豪敏.病原微生物保藏研究进展［J］.中国地方病防治杂志，2012，20(5):342－344.