β-谷甾醇对T47D细胞雌激素受体表达及其下游基因PS2的影响*

陶仕英，牛建昭△，赵丕文，郝庆秀，杨美娟，孙艳玲，张丽娟

(1．北京中医药大学基础医学院，北京 100029;2．中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

β-谷甾醇对T47D细胞雌激素受体表达及其下游基因PS2的影响*

陶仕英1，牛建昭1△，赵丕文1，郝庆秀2，杨美娟1，孙艳玲1，张丽娟1

(1．北京中医药大学基础医学院，北京 100029;2．中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

目的:观察β-谷甾醇对T47D细胞雌激素受体(estrogen receptor，ER)及下游基因PS2的影响，探讨其植物雌激素样作用机制。方法:以ER拮抗剂ICI182 780为工具药，应用实时荧光定量PCR技术检测ERα、ERβ及PS2mRNA表达变化，western-blot技术检测ERα、ERβ蛋白表达变化。结果:β-谷甾醇可诱导ERα、ERβ及PS2 mRNA表达，且上调ERβ更显著，对PS2 mRNA的诱导作用可以被ICI182 780抑制，能够上调ERα和ERβ蛋白表达，且可以被ICI182 780抑制。结论:β-谷甾醇可以通过ER途径调节下游靶基因的表达而发挥植物雌激素样作用。

β-谷甾醇;T47D;PS2;雌激素受体;植物雌激素

细胞雌激素受体(estrogen receptor，ER)是一类甾体激素核受体超家族成员，目前发现ER有两种亚型，即ERα和ERβ。经典的雌激素作用机制认为，ER上的配体结合区与配体雌激素结合，使ER发生二聚体化，进一步使ER上的DNA结合区与靶基因启动子上的雌激素应答元件相结合，启动靶基因的转录［1］。β-谷甾醇(β-sitostero，BSS)是植物固醇的一种，广泛存在于植物的种子和果实中。前期研究发现，10－7mol·L－1和10－8mol·L－1β-谷甾醇的促细胞增殖作用最强，且这种作用可以被雌激素受体完全拮抗剂ICI182 780抑制。对细胞周期的影响可以使S期细胞比例增加，细胞分裂增殖指数升高，说明β-谷甾醇在该浓度下具有植物雌激素样作用，而从中草药及天然植物中开发植物雌激素，防治与体内激素水平相关肿瘤、心血管疾病及更年期综合症日益受到研究者的关注，因此对其作用机制的研究自然成为世界关注的热点。本实验将以ER阳性人乳腺癌细胞系T47D细胞为研究对象，通过观察β-谷甾醇及在ICI182 780干预下，对ERα和ERβ的表达及下游基因PS2的影响，进一步探讨β-谷甾醇发挥植物雌激素样作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

β-谷甾醇购自中国药品与生物制品检定所，实验时以无水乙醇溶解，终浓度为 10－7mol·L－1。DMEM(高糖)、无酚红DMEM(高糖)、胎牛血清、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT-FBS)为Hyclone公司产品;雌二醇(E2)为Sigma公司产品; Trizol为Invitrogen公司产品;ICI182 780为Tocris公司产品;ERα:rabbit polyclonal antibody，ERβ:rabbit polyclonal antibody，Actin:rabbit polyclonal antibody和Peroxidase conjugated affinipure goat anti-ribbit IgG为Santa Cruz公司产品，One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit为宝生物工程(大连)有限公司产品，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 细胞株

人乳腺癌细胞株(T47D)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.3 T47D细胞培养

雌激素敏感性人乳腺癌T47D细胞，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2，相对饱和湿度条件下常规培养。实验开始前4 d将细胞用PBS洗涤后，改用无酚红DMEM(含5% CDT-FBS)培养液中培养，以增加细胞对雌激素样物质作用的敏感性。

1.4 Western blot检测

将T47D细胞以5×105个/瓶的密度接种于25cm2的培养瓶中，24 h待细胞贴壁后加入受试物: 10－7mol·L－1β-谷甾醇，同时设置阳性对照组(10－8mol·L－1E2)和溶剂对照组(0.1%乙醇)。在β-谷甾醇和E2拮抗组中同时加入10－7mol·L－1ICI182 780。收集药物处理48 h的待测细胞，预冷的PBS洗涤3遍后，加入RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，充分裂解后，低温离心机12000 r·min－1离心15 min，Bradford法定量蛋白浓度，取20 μg蛋白加入上样缓冲液，99℃变性5 min，10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后加相应二抗37℃孵育1 h，TBST缓冲液清洗3遍，每次15 min，将膜浸没于配置好的ECL超敏感光混合液，暗室中经显影及定影获得结果，并采用Bio-Rad公司的Quantity one软件分析结果。

1.5 real-time PCR检测

表1显示，引物序列、片段长度和退火温度。收集药物处理48 h的待测细胞，加入1 ml Trizol分离提取总RNA，并进行RNA纯度和浓度测定;利用One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR反应，按照试剂盒说明书进行;利用Roche Light Cycler2.0全自动荧光定量PCR仪软件进行结果分析，mRNA的表达量用相对定量的方法来表示，采用2－△△Ct的方法［2］。

表1 ER及其下游基因引物序列及扩增产物片段长度

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有统计资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-谷甾醇及与ICI182 780作用下对T47D细胞ERα蛋白表达的影响

图1表2显示，与溶剂对照组比较，E2可诱导T47D细胞ERα蛋白表达水平显著升高，相对表达量达2.81，且这种诱导作用可被雌激素受体完全拮抗剂ICI182 780抑制。10－7mol·L－1β-谷甾醇可诱导ERα蛋白表达，相对表达量达2.86，且同样可以被ICI182 780抑制。

2．2 β-谷甾醇及与ICI182 780作用下对T47D细胞ERβ蛋白表达的影响

图2表2显示，T47D细胞ERβ蛋白低表达，溶剂对照组相对表达量仅有 0.21，E2可显著诱导T47D细胞ERβ蛋白表达水平，相对表达量高于溶剂对照组达0.29，且可以被雌激素受体完全拮抗剂ICI182 780抑制。10－7mol·L－1β-谷甾醇可诱导ERβ蛋白表达，相对表达量达0.28，且同样可以被ICI182 780抑制。

图1 β-谷甾醇干预ERα蛋白的表达

图2 β-谷甾醇干预ERβ蛋白表达

2.3 β-谷甾醇作用下对T47D细胞ERα和ERβmRNA表达的影响

表3显示，相对表达量结果显示:雌二醇可以诱导ERα和ERβmRNA表达，β-谷甾醇亦可上调ERα和ERβ，相对表达量明显升高，且与雌二醇比较，上调ERβ表达更显著，约为溶剂对照组的7倍左右。

表2 各组ERα和ERβ蛋白的相对表达量(±s)

表2 各组ERα和ERβ蛋白的相对表达量(±s)

注:与溶剂对照组比较:*P＜0.05;与雌二醇组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与β-谷甾醇组比较:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

组别 例数 ERα ERβ溶 剂 对 照 3 2.19±0.05 0.21±0.04雌 二 醇 3 2.81±0.23* 0.29±0.01*β -谷 甾 醇 3 2.86±0.37* 0.28±0.03*雌 二 醇 + ICI 3 1.73±0.14△ 0.18±0.01△△β-谷甾醇 +ICI 3 1.61±0.23☆ 0.18±0.00☆☆

表3 β-谷甾醇对T47D细胞ERmRNA相对表达量的影响(±s)

表3 β-谷甾醇对T47D细胞ERmRNA相对表达量的影响(±s)

注:与溶剂对照组比较:＊＊P＜0.01

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2.4 β-谷甾醇及与ICI182 780作用下对T47D细胞PS2表达的影响

表4显示，雌二醇可诱导PS2 mRNA表达，诱导作用可以被雌激素受体完全拮抗剂ICI182 780拮抗，β-谷甾醇亦可诱导PS2 mRNA表达，相对表达量明显增多，且ICI182 780能够抑制其诱导作用。

表4 β-谷甾醇及ICI182 780对T47D细胞PS2 mRNA相对表达量的影响(±s)

表4 β-谷甾醇及ICI182 780对T47D细胞PS2 mRNA相对表达量的影响(±s)

注:与溶剂对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例数 PS2溶 剂 对 照 3 1雌 二 醇 3 10.73±0.65＊＊β - 谷 甾 醇 3 10.65±0.98*雌 二 醇 + ICI 3 2.79±0.73 β-谷 甾 醇+ ICI 3 0.72±0.11

3 讨论

流行病学调查发现，许多与雌激素相关的疾病如骨质疏松、心血管疾病、前列腺癌和子宫内膜癌等恶性肿瘤患病率与大豆的摄取呈负相关，尤其东亚国家因这些肿瘤导致的死亡率明显低于欧美国家，这与以植物性食物为主的膳食习惯关系密切。大豆等植物性食物中富含大豆苷元、染料木黄酮、鸡豆素A等植物雌激素成分，因此植物雌激素对这些疾病的保健和治疗作用日益受到关注。β-谷甾醇存在于多种天然植物的坚果和种子中，也存在于多种药用植物中，如白花蛇舌草、半夏、天南星、地黄、白芥子等，可以降低饮食中胆固醇的吸收，因此长期以来研究者主要研究其对心血管疾病的保护作用［3-4］。近年来，随着研究的不断深入，β-谷甾醇的抗肿瘤作用已成为研究热点。应用不同ER状态的乳腺癌细胞株，研究者们［5-6］通过体外实验发现，β-谷甾醇能够诱导ER(-)的乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡、阻滞细胞周期进展等抑制其增殖;对于ER(+)乳腺癌细胞株MCF-7β-谷甾醇则有促进增殖作用。研究者认为，这种矛盾可能与β-谷甾醇具有植物雌激素样作用有关。早在1993年，Malini T［7］等研究发现，单纯或与E2合用β-谷甾醇可使去卵巢动物子宫质量明显增加。后来研究者们［8］发现，亲代水貂喂养β-谷甾醇9个月，子代水貂通过妊娠和哺乳后相对子宫质量低于正常对照组。这些实验结果说明，β-谷甾醇具有植物雌激素作用，能引起动物生殖器官质量的改变。随后β-谷甾醇被作为植物雌激素进行了大量的体外实验研究，研究发现［9］β-谷甾醇是弱的雌激素受体ERα和ERβ激动剂，尤其易于结合ERβ，但对于β-谷甾醇发挥植物雌激素作用的机制未见详细报道。

本实验应用人乳腺癌T47D细胞作为研究对象，T47D细胞为ERα和ERβ双阳性表达细胞，但以ERα表达占优势［10］。结果亦发现，ERβ蛋白在人乳腺癌T47D细胞的正常对照组中表达明显低于ERα蛋白的表达。10－7mol·L－1β-谷甾醇可诱导T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达，且这一作用可被雌激素受体完全拮抗剂ICI182 780所抑制。ICI182 780又名Fulvestrant，是一种甾体类雌激素受体完全拮抗剂，研究发现其可以通过多种途径发挥生物学活性。Wakeling AE等［11］发现，ICI182 780可抑制雌二醇与ER的结合，其与ER结合亲和力达雌二醇的89%。Fawell和Danvois等［12-13］发现，Fulvestrant-ER结合破坏受体二聚体化及依赖能量的配体-受体复合物的核质穿梭，从而影响受体的核定位。且这种受体-配体复合物不稳定，增加ER受体蛋白的降解，细胞ER蛋白的下调并不伴随ERmRNA的减少［14］。在基因水平上，本研究发现 β-谷甾醇可诱导ERα和ERβ mRNA表达，且与E2比较对ERβ诱导作用更加显著。大量体外实验证实［15-16］，不同的植物雌激素对ERα和ERβ的亲和力不完全相同，多数植物雌激素对ERβ的亲和力高于ERα，如香豆雌酚对ERβ的亲和力比ERα高7倍。本实验结果也显示，β-谷甾醇与E2比较，通过选择性调节ER的活性而发挥作用。本实验中T47D细胞ERα表达占优势，所以对其下游基因的诱导表达主要通过ERα介导，从而诱导PS2基因转录，相对表达量升高，并可以被ICI182 780拮抗。

以上结果说明，β-谷甾醇能够通过ER诱导雌激素效应基因的表达而发挥作用，同时也提示下一步实验可进一步观察β-谷甾醇通过ER募集的辅调节蛋白如何调节基因的转录活性，以期更全面、准确地分析不同雌激素类化合物的作用机制，为临床用药提供理论指导。

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Effects of β-sitosterol on the expression of T47D cells estrogen receptors and its downstream gene PS2*

TAO Shi-ying1，NIU Jian-zhao1△，ZHAO Pi-wen1，HAO Qing-xiu2，YANG Mei-Juan1，SUN Yan-ling1，ZHANG Li-juan1
(1．School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;2．Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medicinal Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe the effect of β-sitosterol on ER and downstream gene PS2 expression in breast cancer cell line T47D cells，and explore its phytoestrogenic mechanism．Methods:mRNA expressions of ERα，ERβ and its downstream gene PS2 in T47D were assessed by RT-PCR，protein expressions of ERα、ERβin T47D were assessed by western-blot．ICI182 780 was employed to observe the influence on the gene expressions of PS2 and protein expressions of ERα，ERβ．Results:β-sitosterol up-regulated ERα，ERβmRNA expression．PS2 gene are induced in response to β-sitosterol treatment．The effect on PS2 gene expression was inhibited by pure estrogen receptor antagonist ICI182780．β-sitosterol increased the level of T47D cells ERα，ERβ proteins expression，respectively．The effect was completely antagonized by ICI182 780．Conclusion:β-sitosterol up-regulated downstream gene PS2 expression through ER．And β-sitosterol possessed phytoestrogenic effect by activating ER．

β-sitosterol;T47D;PS2;Estrogen receptor; Phytoestrogen

R285．5

B

1006-3250(2015)02-0165-03

2014-11-14

国家自然科学基金资助项目(30772849，81273887);高等学校学科创新引智计划资助项目(B07007);北京中医药大学自主选题项目(0100604006);教育部大学生创新性实验计划项目(201310026056)

△通讯作者:牛建昭，E-mail:niujianzhao@126．com。