加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织核转录因子-κB、锌指蛋白A20表达的影响*

张海英，闫玲玲，杨爱东，吴中华，符胜光，庞慧芳

(上海中医药大学，上海 201203)

加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织核转录因子-κB、锌指蛋白A20表达的影响*

张海英，闫玲玲，杨爱东△，吴中华，符胜光，庞慧芳

(上海中医药大学，上海 201203)

目的:观察加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织核转录因子-κB 65(NF-κB65)、锌指蛋白A20蛋白及其基因表达的影响。方法:Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、地塞米松和加味小青龙汤组。采用脂多糖气管滴注联合烟熏方法建立COPD大鼠模型，检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量，检测肺组织NF-κB65、A20蛋白及其基因表达，观察加味小青龙汤对上述指标及肺组织病理形态学变化的影响。结果:与正常组比较，模型组TNF-α、IL-1β、NF-κB和A20蛋白及其基因表达均明显上调;与模型组比较，加味小青龙汤组TNF-α、白介素-1β、NF-κB蛋白表达明显降低，加味小青龙汤组A20基因表达显著上调。病理观察结果显示，与正常组比较，模型组肺组织炎症细胞浸润，管腔中有大量中性粒细胞及黏液聚集，管壁明显增厚，胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生;加味小青龙汤组肺组织病理改变明显轻于模型组，加味小青龙汤组肺组织少数呈轻度间质性肺炎，仅见少量的纤维组织增生。结论:加味小青龙汤能够减轻COPD模型大鼠肺组织损伤，对COPD模型肺组织有保护作用，其机理可能与其降低TNF-α和白介素-1β含量、下调NF-κB蛋白表达、上调A20基因表达有关。

加味小青龙汤;慢性阻塞性肺疾病;核转录因子-κB;锌指蛋白A20

研究表明，在肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞中，炎症介质的基因表达与核转录因子-(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活相关;而NF-κB在呼吸道炎症的调节方面起关键作用，能促进TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-8的表达，加重慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的气道炎症［1］。锌指蛋白 A20是NF-κB信号传导的一种内源性负调节子［2］。我们既往研究表明，加味小青龙汤对内毒素致大鼠肺损伤有保护作用，其机制与该方能降低急性肺损伤肺组织TLR4mRNA表达有关［3］。本研究观察了加味小青龙汤对COPD大鼠肺组织NF-κB65、A20蛋白及其基因表达的影响，并探讨加味小青龙汤的作用机制。

1 材料

1.1 动物

清洁级Wistar雄性大鼠32只，体质量(220± 20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供(动物合格证号SCXK(沪)2010-005)，专用标准颗粒饲料、水喂养。

1.2 药物

加味小青龙汤由炙麻黄、桂枝、干姜、细辛、甘草、半夏、五味子、白芍、石膏、鱼腥草、开金锁11味中药按一定比例组成。浓缩成2 g原药材/mL的水煎液，高温高压灭菌，4℃冷藏备用。中药饮片均购自上海曙光医院东院，地塞米松购自上海信谊药厂有限公司(批号01120302)。

1.3 仪器

低温冷冻离心机3K15，Sigma(美国);生物安全柜TYPE B2，Sigma(美国);BH2显微镜OLYMPUS (日本);Real-time检测仪(7300Sequence Detection System)、ABI-7300 ABI(美国)。

1.4 试剂

LPS冻干粉剂(O111:B4)购自美国Sigma公司(批号L1430);引物和探针序列。NF-kBp65:上游: 5'-GCGTTTCCGTTACAAGTGCG-3'，下游:5'-GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTGC-3';A20:上游: 5'-AACTGGTGTCGTGAAGTCAGGA-3'，下游:5'-TCCTGAACACCCCACATGTACT-3';ACTIN:上游引物:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，下游引物: 5'-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3'，5'端FAM修饰，3'端Tamra修饰。Trizol总RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。白沙烟香烟(白盒，软包)，湖南中烟工业有限责任公司生产，烟气烟碱量1.0 mg，焦油12 mg，一氧化碳14 mg。自制烟熏箱:30 cm×40 cm×60 cm有机透明储物箱。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

按随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松组和加味小青龙汤组各8只。参照文献［4］方法并加以改良建立COPD大鼠模型。分别于实验开始的第1、14天给予气管内滴注脂多糖，剂量为2 mg/kg。分别于第2天至第13天及第15天至第28天，每日同一时间将大鼠置于72 L(宽30 cm，高40 cm，长60 cm)自制有机透明储物箱内，进行香烟烟雾暴露1次，每次10支，每次0.5 h。暴露方法为:将点燃的白沙牌香烟通过悬挂方法，将烟雾注入自制箱内。正常组用生理盐水气管滴注，在自制箱内吸入正常空气。加味小青龙汤组在第2～13天、第15～28天给予大鼠灌服加味小青龙汤溶液(7.56 ml/kg)，地塞米松组灌胃剂量为0.2 mg/kg，正常组、模型组在相应时点灌服等体积蒸馏水。各组动物用药量按人与动物的体表面积换算［5］。

2.2 标本采集

所有动物于造模后第29天用20%乌拉坦5.0 ml/kg腹腔麻醉。支气管肺泡灌洗液收集:动物麻醉，大鼠颈部气管纵行切口，用剥离针逐层分离组织，最终暴露气管。于气管下方置一零号手术线，用眼科剪横剪一小口，用灌洗针(16号针头改良而成)从剪开的小口处插入气管，用手术线扎牢，再将针往气管内推入少许，用橡皮泥固定。用止血钳夹住右侧三叶的肺根部右支气管，以免灌洗时被损伤。2次抽取3 ml生理盐水灌洗支气管，每次反复回抽3次，回收灌洗液于一离心管中，用于TNF-α、IL-1β测定。肺脏样本:剖去肺部周围组织，取右肺上叶，生理盐水冲洗后放入10%甲醛溶液中保存，用于肺病理检测及肺组织NF-kBp65、A20免疫组化检测;取右肺下叶置于液氮罐中做肺组织 NF-kBp65、A20mRNA表达检测。

2.3 肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β含量测定

取支气管肺泡灌洗液，在离心机中3000 r/10 min后取上清液，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定灌洗液中的TNF-α、IL-1β含量。

2.4 肺组织NF-kBp65和A20蛋白表达测定

采用IMS细胞图像分析系统软件，对免疫组织化学结果进行图像采集和定量分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野，细胞核为蓝色，NF-kBp65和A20阳性细胞为棕黄色。计算出每例样本的蛋白染色阳性细胞面积率(蛋白染色阳性细胞面积率=阳性细胞面积/总面积)作为比较参数。

2.5 肺组织 NF-kBp65和 A20 mRNA表达测定

按美国Invitrogen公司Trizol试剂提取总RNA后，逆转录合成 cDNA。12 μL反应体系中，10 mmol/L dNTP1 μL，随机引物1 μL，标本RNA 2 μg，混匀后于65℃ 5 min快速插入冰水中离心，冰上加入:5×buffer 4 μL，DTT(100 mmol·L－1)2 μL，RNAsin(40 U/μL)1 μL，M-MLVRT反转录酶(200 U/μL)1 μL，37℃50 min，70℃ 15 min，－20℃保存。PCR扩增:Sybr green 10 μL，上游引物:(5 μmmol· L－1)2 μL，下游引物:(5 μmmol·L－1)2 μL，反转录产物2 μL。扩增条件:①95℃ 10 s;②95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycle。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析。NF-kBp65和 A20 mRNA表达水平以它们与ACTIN的相对表达量来计算。

2.6 病理观察

取右上肺组织常规10%甲醛固定，逐级脱水，取1 cm×1 cm×0.3 cm石蜡包埋，用切片机切取一片漂片，HE及胶原染色，光镜下观察肺组织病理形态学变化。

3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示，多组均数采用方差分析，组间两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 加味小青龙汤对大鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影响

表1显示，与正常组比较，模型组支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量显著升高(P＜0.01);与模型组比较，加味小青龙汤组和地塞米松组支气管肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)

表1 各组大鼠支气管灌洗液中TNF-α、IL-1β含量比较(±s)

表1 各组大鼠支气管灌洗液中TNF-α、IL-1β含量比较(±s)

注:与正常组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

组别 鼠数 TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml)正 常 组 8 154.6±7.85 75.63±4.94模 型 组 8 172.1±5.68△△ 83.04±3.93△△地 塞 米 松 组 8 159.2±11.72▲▲ 76.02±3.63▲▲加味小青龙汤组 8 159.7±11.74▲ 76.99±6.94▲

4.2 加味小青龙汤对大鼠肺组织NF-κB65、A20蛋白表达的影响

表2显示，与正常组比较，模型组肺组织NF-κB65、A20蛋白阳性面积率明显升高(P＜0.01);与模型组比较，地塞米松组肺组织NF-κB蛋白阳性面积率明显降低(P＜0.05)，肺组织A20蛋白阳性面积率明显升高(P＜0.05)，加味小青龙汤组NF-κB蛋白阳性面积表达率明显降低(P＜0.01)。

4.3 加味小青龙汤对大鼠肺组织NF-κB65、A20基因表达的影响

表3显示，与正常组比较，模型组肺组织中NF-κB65、A20基因表达明显升高(P＜0.05，P＜0.01);与模型组比较，地塞米松组肺组织NF-κB65基因表达明显降低(P＜0.05)，肺组织A20基因表达显著升高(P＜0.05)，加味小青龙汤组肺组织A20基因表达明显升高(P＜0.01)。

表2 各组大鼠肺组织NF-κB65、A20蛋白阳性面积率的比较(±s)

表2 各组大鼠肺组织NF-κB65、A20蛋白阳性面积率的比较(±s)

注:与正常组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

组别 鼠数 NF-κB65(%) A20(%)正 常 组 6 6.26±2.32 4.44±1.45模 型 组 6 10.47±2.88△△ 7.23±1.52△地 塞 米 松 组 6 7.67±1.56▲ 10.56±3.43△△▲加味小青龙汤组 6 6.41±1.06▲▲ 8.75±0.99△△

表3 各组大鼠肺组织NF-κB65、A20基因表达的比较(±s)

表3 各组大鼠肺组织NF-κB65、A20基因表达的比较(±s)

注:与正常组比较:△△P＜0.01，△P＜0.05;与模型组比较:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05

组别 鼠数 NF-κB65mRNA (×10－2) A20mRNA (×10－2)正 常 组 8 0.59±0.14 0.64±0.26模 型 组 8 0.89±0.25△△ 0.93±0.26△地 塞 米 松 组 8 0.73±0.11▲ 1.23±0.29△△▲加味小青龙汤组 8 0.76±0.10△ 1.35±0.23△△▲▲

4.4 各组大鼠肺组织病理形态观察

图1显示，光镜观察正常组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺间质无炎细胞浸润，胶原染色未见明显纤维组织增生;模型组肺组织炎症细胞浸润，管腔中有大量中性粒细胞及黏液聚集，管壁明显增厚，胶原染色示肺间质纤维组织大量增生;地塞米松组肺间质极少量炎症细胞浸润，胶原染色示肺间质少量纤维组织增生;加味小青龙汤组肺间质少量炎症细胞浸润，胶原染色示肺间质少量纤维组织增生。

5 讨论

COPD属于中医学“咳嗽上气”“肺胀”“痰饮”“喘证”等范畴。中医学认为COPD为本虚标实之证，内脏阳气不足是本虚，而重在肺、脾、肾三脏阳气虚衰，寒饮内停是其标实，外感风寒为主要诱因。肺脾肾阳气不足，痰饮内停，加之风寒袭肺，肺卫失宣，未能及时表散，内蕴不解，郁而化热，导致肺气上逆而出现咳、痰、喘等表现。根据COPD的临床症状，结合以往的治疗经验我们认为，COPD的病机演变早期多见外寒内饮、郁久化热，治宜温肺化饮兼解郁热，方选加味小青龙汤。

典型的NF-κB是异源二聚体，在调节机体基因转录中有重要作用。NF-κB与 IκB(inhibitor κB，IκB)的解离是活化的关键，而IκB磷酸化是IκB与NF-κB解离的前提［6］。NF-κB必须首先从胞浆进入胞核活化，才能发挥基因转录的调控作用。许多因素均可导致NF-κB的活化，脂多糖、TNF-α和IL-1是诱导NF-κB活化很强的诱发因子［7］。NF-κB可通过调控细胞IL-1β、TNF-α等炎症介质的表达，参与肺部炎症和免疫调节［8］。研究表明，COPD患者病情恶化时痰巨噬细胞NF-κB65的阳性表达明显增加。从吸烟者和COPD患者气管黏膜活检中发现，气道上皮细胞中NF-κB65阳性表达明显增加，且与疾病的严重程度相关［9］，可见NF-κB在气道炎症中起关键作用，与COPD的严重程度有关。

A20是一种泛素修饰酶，其表达在受刺激的淋巴细胞和肺支气管上皮细胞内［10］。A20蛋白是机体重要的炎症反应负性调节子，研究表明，A20在呼吸系统疾病中发挥着重要作用，能够减轻小鼠过敏性炎症反应的发生［11］。锌指蛋白 A20与NF-κB的过度活化有着密切联系，A20能够去除因NF-κB活化而涉及多种蛋白的泛素化链，抑制其活化来减少炎症的发生，NF-κB活化能使A20表达增高，从而起到炎症负性调节的作用［12-13］。缺失A20基因，增加IκB激酶(inhibitor of NF-κB kinase，IKK)的活性，从而促使NF-κB的活化延长［14］。

本实验研究结果表明，与正常组比较模型组肺组织炎症细胞浸润，管腔中有大量中性粒细胞及黏液聚集，管壁明显增厚，胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生，表明COPD模型复制成功，且模型组支气管肺泡灌洗液中，TNF-α和IL-1β含量、肺组织NF-κB和A20蛋白及基因表达升高，表明COPD发病机制与TNF-α和IL-1β含量、NF-κB和A20蛋白及其基因表达升高有关。与模型组比较，加味小青龙汤组肺组织病理改变减轻，且加味小青龙汤组支气管肺泡灌洗液中，TNF-α和IL-1β含量、肺组织NF-κB蛋白表达明显降低，肺组织A20基因表达明显升高。表明加味小青龙汤能够减轻COPD模型大鼠肺组织损伤，对COPD模型肺组织有保护作用，其机理可能与其能够降低TNF-α和IL-1β含量、下调NF-κB蛋白表达、上调A20基因表达有关。

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Effects of modified Xiaoqinglong Decoction on the expression of nuclear transcription factor-κB and zinc protein A20 in lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease

ZHANG Hai-ying，YAN Ling-ling，YANG Ai-dong△，WU Zhong-hua，FU Sheng-guang，PANG Hui-fang
(Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，shanghai 201203，China)

Objective:To investigate Effects of Additional Xiao Qing Long Decoction(AXQLD)on Lung Expression of NF-kBp65 and A20 protein and its mRNA in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．Methods:Wistar rats was randomly divided into normal control group，model control group．The COPD model of rats were bulit by the Lipopolysaccharide tracheal instillation and smudging．TNF-α and L-1β in the bronchoalevlar lavage fluid were measured，and the expression of NF-κB and A20 protein and its mRNA in lung tissue were measured．While the histopathology of the lung tissue was observed by light microscope．Results:Compared with the normal control group，TNF-α and IL-1β and the expression of NF-κB，A20 protein and its mRNA were obviously increased in model group．Compared with model group，TNF-α and IL-1β and the expression of NF-κB protein were obviously decreased in AXQLD group;The expression of A20mRNA was obviously increased in AXQLD group．Light microscope observation indicates that there were severe interstitial pneumonia，the destruction or disappearance of alveolar structure，the infiltration of the inflammatory cells，pulmonary interstitial fibrous tissue hyperplasia with great quantities in the model group．while the pathological manifestations were much more ameliorated than those of the model group，the mild interstitial pneumonia and only a small amount of fibrous tissue hyperplasia were showed in the AXQLD．Conclusion:AXQLD lessens the injury of lung tissue and has protective effects on COPD rats，the mechanism is possibly related to the inhibition of TNF-α，IL-1β，and down-regulatation the expression of NF-κB protein and up-regulatation the expression A20mRNA in COPD rats．

Additional Xiao Qing Long Decoction;Chronic obstructive pulmonary disease;NF-κB;A20

R258．5

B

1006-3250(2015)02-0149-04

2014-11-14

国家中医药管理局重点学科项目(中医各家学说2009);上海市重点学科建设资助项目(S30301);上海市教委预算内科研项目(2011JW89);上海中医药大学中医临床基础学科建设、名师研究室及基础医学院攀登计划项目(12ZLJ08、Z1301011310、A1-N1401011326);上海中医药大学研究生创新能力培养专项项目(P2910302)

张海英(1987-)，女，河南周口人，医学硕士，从事中医药防治呼吸系统疾病的临床与研究。

△通讯作者:杨爱东(1968-)，男，湖北宜昌人，教授，医学博士，从事中医药防治呼吸系统疾病的临床与研究，E-mail:aidongy@ 126．com。