艾灸对AD大鼠学习记忆、GSK-3β和磷酸化tau蛋白的影响*

王静蓉，张玉杰，姜美驰，梁 静，许建阳△，黄汉昌，姜招峰

(1．辽宁医学院，辽宁锦州 121001;2．武警总医院，北京 100039; 3．北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

艾灸对AD大鼠学习记忆、GSK-3β和磷酸化tau蛋白的影响*

王静蓉1，张玉杰1，姜美驰1，梁 静2，许建阳2△，黄汉昌3，姜招峰3

(1．辽宁医学院，辽宁锦州 121001;2．武警总医院，北京 100039; 3．北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

目的:探讨艾灸防治阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)的作用及其机制。方法:大鼠双侧脑室微量注射STZ造模，术后第10天艾灸组灸“关元”“长强”“命门”“百会”，同时西药对照组灌胃盐酸多奈哌齐，治疗30 d后用Morris水迷宫测各组大鼠学习记忆能力，再取材用ELISA法、免疫组织化学、Western blot等检测海马区GSK-3β活性及tau蛋白磷酸化位点(Ser396/ Thr231)的含量和表达水平。结果:艾灸组与西药对照组较模型组平均游泳距离百分比上升;与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区椎体细胞形态结构异常，阳性染色深，而艾灸组与西药对照组较模型组形态结构完整，阳性染色浅;除假手术组外，GSK-3β活性及磷酸化tau蛋白Ser396、thr231位点相对表达量均升高，且西药对照组和艾灸组低于模型组。结论:艾灸可部分改善AD大鼠学习记忆，其可能通过抑制海马GSK-3β活性，降低p-tau S396、T231的磷酸化水平起到防治AD的作用，且作用效果与西药盐酸多奈哌齐相同。

阿尔茨海默;艾灸;链脲佐菌素GSK-3β;Ser396;Thr231

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种临床常见神经系统退行性疾病，以认知功能障碍为临床特点，主要表现为学习记忆能力下降等，常起病隐匿，病情呈进行性加重。其主要病理特征是Aβ沉积形成的老年斑(SP)和过度磷酸化Tau蛋白导致的神经纤维缠结 (NFT)［1］。关于AD早期的发病机制有许多假说，其中Tau蛋白学说是目前研究导致AD发病的主要机制之一，即正常结构的Tau蛋白原本是稳定细胞骨架的重要成分，由于各种原因诱使tau蛋白异常过度磷酸化后，导致正常细胞结构被破坏，极易形成NFT，最终促成AD。而GSK-3β能调控磷酸化tau蛋白的表达水平，进而影响AD的发生发展。

对已形成的病理产物不易消除是导致临床中晚期AD治疗花费大、收效差和致死率高的重要原因，故现代研究把目光转向AD的早期防治。

艾灸“治未病”在防治老年痴呆、改善认知方面有较好的临床疗效［2-3］。近年来，一些研究［4-5］从神经突触可塑性、热休克蛋白等方面研究艾灸防治AD的机理。但其对AD大鼠海马内tau蛋白磷酸化水平等方面有何影响且作用机制如何尚未清晰。因此，本文用STZ侧脑室注射造模、早期介入艾灸干预，以期从干预后大鼠学习记忆、海马内GSK-3β活性、p-tau S396、T231的表达情况，探讨艾灸对防治AD的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

选取2月龄雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(300±30)g，适应性喂养3 d后，按随机数字表法分为假手术组12只，手术组48只。术后观察9 d，去除死亡大鼠12只，其余36只手术伤口愈合良好，饮食水及二便正常，再利用随机数字表法分为模型组、西药对照组和艾灸组，每组各12只。

1.2 主要试剂与仪器

链脲佐菌素STZ(sigma);GSK-3β ELISA试剂盒(北京普尔伟业);抗体 :GSK3-β、p-tau S396、T231、β-Actin(Abcam);BCA蛋白定量试剂盒与HRP山羊抗兔IgG(H+L)二抗(鼎国昌盛);超敏型二步法检测试剂盒(中杉金桥)及艾绒等大鼠脑立体定位仪(瑞沃德);微量注射器(hamilton);Morris水迷宫，Noldus EhonVision图像采集分析系统;酶标仪(Bio-tek);电泳仪、转膜仪(Bio-Rad);ECL凝胶成像系统(GE Healthcare);电泳成像分析系统Image Quant RTECL(BD Bioscience);倒置显微镜(olympus);切片机、包埋机(Leica)及乐灸牌艾条机等。

1.3 造模

所有大鼠经10%水合氯醛(3.5～4.5 mL/kg)麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒，正中矢状位切开分离骨膜，牙科钻钻开颅骨暴露前后囟。除假手术组外，其余3组用双侧侧脑室各注射STZ约10 μL(3 mg/kg，注射前将STZ溶于柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，浓度为0.1 mol/L，pH=4.2～4.4)。参考《大鼠脑立体定向图谱》［6］确定打孔点坐标:前囟后1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm，脑表面下3.5 mm。注射后留针5 min缓慢出针。缝合创口处滴青霉素。第3天重复注射(剂量同前)。假手术组以等量柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液替代STZ。术后禁食24 h后，恢复常规饲养，连续5 d肌注庆大霉素3 U/d，以防感染。

1.4 干预

术后观察9 d，从第10天开始干预。艾灸组治疗时将大鼠从笼内轻轻取出，注意动作柔和，避免惊吓，用柔软透气性好且避光的布巾轻缓裹住大鼠头部，待其消除恐惧感后，无须强行固定，将其仰面安靠在灸台的海绵垫上，整个过程大鼠处于清醒状态，只由1人独立操作以减少干扰，有利于保持大鼠施灸状态平稳。具体施灸方法，图1所示，以左手虎口，左手大拇指、食指、中指三指适度卡住大鼠头、颈、肩，另一只手持特制细艾条取腹部“关元”穴，悬灸距皮肤3～4 cm，穴位皮肤温度保持(37±2)℃之间，15 min/次，然后撤去艾条，将其轻轻翻转成俯卧位，此时若大鼠受惊，稍加抚慰待其状态恢复平静再按次序施灸于“长强”、“命门”、“百会”，每次灸时分别为长强、命门各7 min，百会3 mim，具体操作以皮下温热小动物不烦燥为度，隔2 d灸，10次为1个疗程，共30 d。艾灸条均为艾条机手工压制，直径1 cm，艾绒净重(5.5 g±0.2)g/支;西药对照组给予盐酸多奈哌齐混悬液进行灌胃，其中盐酸多奈哌齐按1 mg/kg计算用药量，每日1次，每次灌胃量不超过3 ml共30次;假手术组、模型组不处理。

图1 小白鼠施灸方法

1.5 Morris水迷宫行为学检测

治疗30 d后的第2天开始定位航行实验。平台随机固定于某一象限内不动，在每个象限边缘取1个起始点，每次训练选1个不同起始点，将大鼠头冲上、面向池壁放入池内，以大鼠找到平台并在台上停留3 s记为1次训练结束时的潜伏期，若大鼠在120 s内找不到平台，将其引导至平台上，潜伏期记为120 s。之后大鼠停留在平台30 s，用以记忆空间。每天训练分上、下午各2次，分别从上午8点和下午1点开始训练，每只大鼠每天共训练4次，实验共历时4 d。

1.6 脑组织样品处理

测试结束后的第2天将大鼠断头取脑，冰上快速分离左右半脑，一半脑置于4%多聚甲醛固定48 h后常规石蜡包埋，另一半取海马组织放入冻存管中，置于液氮罐中速冻，然后转移到－80℃冰箱中备用。

1.7 指标检测

1.7.1 成像系统自动记录定位航行 实验中每组12只大鼠每天4次检测训练的潜伏期及游泳距离百分比，取其平均值作为大鼠平均潜伏期和平均游泳距离百分比。

1.7.2 ELISA法检测大鼠海马GSK-3β活性

每组随机取6只大鼠海马组织冰上研磨，充分裂解、匀浆、离心取上清，按试剂盒操作测出样品吸光度值，再计算出GSK-3β的活性量。

1.7.3 免疫组化 将蜡块连续切片，片厚5μm，每隔20张取1张做HE染色，根据染色结果选取相同位置的海马进行免疫组化染色。其中滴加一抗浓度分别为 p-tauT231 1∶100、p-tau S396 1∶800，阴性对照加PBS。在400倍镜下观察比较各组海马CA1区椎体细胞形态变化以及抗体阳性染色情况。

1.7.4 免疫印迹 每组随机选6个样本分别检测p-tauT231、S396的表达量，每个样品重复测3次，取3次平均值作为结果;采用Quantity One电泳图像分析软件分析所采集的条带灰度值，并以目标条带灰度值比上内参β-actin条带灰度值，表示目标蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析;组间两两比较，方差齐时用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定位航行实验结果

表1显示，模型组大鼠平均潜伏期较假手术组延长，平均游过平台象限距离与总距离百分比下降(均P＜0.05)，说明模型制作是成功的，造模后大鼠的学习记忆能力被明显破坏;与模型组比较，西药对照组平均潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但平均游泳距离百分比有所上升(P＜0.05)，且艾灸组与西药对照组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明艾灸和盐酸多奈哌齐均能部分抑制学习记忆的损伤，起到相同的治疗作用。

2.2 大鼠海马GSK-3β活性

与假手术组比较，各组大鼠海马组织 GSK-3β活性均升高，差异均有统计学意义(均 P＜0.05);与模型组比较，西药对照组和艾灸组大鼠海马组织GSK-3β活性均下降，且西药对照组低于艾灸组，差异均有统计学意义(均P＜0.05)

2.3 免疫组化检测结果

图2显示，400倍光镜下各组大鼠海马区均可见棕褐色阳性表达，反应部位主要位于细胞膜，细胞核呈阴性。与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区椎体细胞排列松散，细胞形态不规则，胞体缩小，部分胞核固缩，突起缩短，出现断裂甚至消失，表达的阳性细胞着色深，说明造模后损伤大鼠海马CA1区椎体细胞且导致tau蛋白位点S396、T231表达水平升高;与模型组比较，西药对照组、艾灸组的椎体细胞排列较紧密，结构较完整，细胞膜、核膜清晰，体积较大，阳性细胞染色淡，说明2种治疗均能一定程度保护CA1区椎体细胞受损，并降低p-tauT231、S396的表达。

图2 A1-D1 4组大鼠海马CA1区椎体细胞p-tauT231阳性细胞表达(DAB显色×400，箭头示p-tauT231阳性细胞)A2-D2 4组大鼠海马CA1区椎体细胞p-tauS396阳性细胞表达(DAB显色 ×400，箭头示p-tauS396阳性细胞)

2.4 Western blot检测结果

图3显示，模型组大鼠海马p-tauT231、S396条带较假手术组明显增粗且颜色浓，提示模型组该蛋白位点的表达量升高;与模型组比较，西药对照组、艾灸组条带细且颜色淡，提示治疗后2组大鼠海马的蛋白位点表达量下降。这与p-tauT231、S396蛋白相对表达量比较(见表1)结果相符，说明艾灸与盐酸多奈哌齐均能一定程度上抑制AD大鼠海马内p-tauT231、S396的磷酸化水平。

图3 Western blotting检测p-tau T231、S396抗体显影条带

表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验结果、海马区GSK-3β活性及p-tauT231、S396蛋白相对表达量比较(±s，均n潜伏期=n距离百分比=12，nGSK-3 β=6，nT231=nS396=3)

表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验结果、海马区GSK-3β活性及p-tauT231、S396蛋白相对表达量比较(±s，均n潜伏期=n距离百分比=12，nGSK-3 β=6，nT231=nS396=3)

注:与假手术组比较:#P＜0.05;与模型组比较:*P＜0.05，☆P＞0.05;与对照组比较:▲P＞0.05，△P＜0.05

组别 平均潜伏期(s)平均游泳距离百分比(%) ELISA Western blot GSK-3β(ng/ml)T231 S396 假 手 术 组 49.64±3.59 38.25±6.11 0.12±0.05 0.23±0.10 0.26±0.09 模 型 组 69.55±4.43 26.47±1.51 0.33±0.19 0.76±0.21 0.77±0.18 对 照 组 60.42±11.76#☆30.29±4.18#*0.21±0.10#*0.34±0.10#*0.40±0.09#*艾 灸 组 70.67± 5.84#▲31.18±4.87#▲0.25±0.14#△0.58±0.12#△0.63±0.07#△

3 讨论

《内经》有云:“人始生，先成精，精成而脑髓生。”肾精主人之生长壮老已，且精生髓化。《中西汇通医经精义》云:“肾系贯脊，通于脊髓，肾精足，则入脊化髓上循入脑而为脑髓，是髓者精气之所会也。”又《素问·骨通论》曰:“督脉者，起于少腹之下……贯脊属肾……上额交颠，入络脑。”可见，肾与脑髓通过督脉相联系［7］。任督二脉均起自胞中，又相交于脑，阴阳环抱，为肾所主，故脑髓之病变可论及肾与任督二脉。

老年痴呆是以肾精亏虚、脑髓失养为病理基础，阳气虚为发病机制的退行性病［8］。故利用艾灸温阳通补的特性，从肾及任督脉论治痴呆。关元乃任脉经穴，足三阴经与任脉之会，温肾固精，培元固本;长强在督脉之端，通于任脉，可调和阴阳、调任督之气;命门补肾益阳;百会位居巅顶，为诸阳之会，可升提阳气，醒脑益智。故艾灸选穴关元、命门阴阳相济，百会、长强高下相合，寓“阴中求阳，阳中求阴”之意，奏“补肾温阳，益智通髓”之功。

“灸”为“久火”，顾名思义是一种以温热刺激为特色的中医常用的治病保健疗法。施灸时通过艾燃烧产生热量，不仅能引起局部组织温度升高同时还伴随产生整体生物效应，其主要以红外辐射的方式传递到治疗部位［9］从而发挥治疗作用。它能显著提高治疗局部与机体整体的能量代谢［10］，可为能量缺乏的病态细胞提供活化能［11］。

本文关于灸法的定量标准做以下相关研究:

许培昌［12］等指出，灸距以3～4 cm为宜，若距离太近，随灸时延长局部皮温过高而灼伤。本实验大鼠皮毛较厚散热缓慢，经反复测试后采用灸质量(5.5±0.5)g、直径1 cm的特制细艾条燃烧时，灸距保持在3～4 cm处，穴位表面的温度保持在(37± 2)℃，大鼠能长时间保持安静不烦燥，这构成本次研究中艾灸持续稳定作用于实验对象的前提。

又以王悦同［13］等研究提出不同穴位应采用不同灸时的理论为指导，在反复测试中发现随灸穴位置深度不同，灸至相应时间后热度可透至皮下穴位处，且大鼠对艾灸的耐受度与穴位特性有关:关元位于腹部，定位较深，可灸15 min，长强、命门次之7min，百会位于头顶皮肤下，为诸阳之会，不可过灸，3min为宜。灸之要气至而有效，灸量不足达不到气至的疗效，灸量过大又会导致邪火内郁，或直接灼伤阴津［14］，故隔2 d灸1次为好［15］。

临床上，AD初期患者脑葡萄糖代谢和细胞能量产生明显受损，并出现胰岛素/胰岛素受体(insulin/insulin receptor，I/IR)信号系统功能紊乱［16］，继而引起tau蛋白过度磷酸化［17］。实验研究证明，STZ侧脑室注射后引起大鼠脑内持久的葡萄糖和能量代谢障碍，并干扰I/IR系统，可以导致tau蛋白的异常磷酸化［18］。根据大鼠双侧侧脑室微量STZ注射后第10天出现病理改变至第60天内逐渐加重的情况［19］，我们在术后第10天开始干预，治疗30 d后即术后第40天连续4 d用定位航行实验检测大鼠学习记忆能力，测试结束第2天即术后第45天取材检测海马GSK-3β活性和p-tauT231、S396表达情况，旨在观察AD发病早期用艾灸干预的疗效。

AD的主要病理特征是SP与NFT。过度磷酸化tau蛋白是NFT的主要成分，其形成主要是由蛋白激酶催化的tau蛋白磷酸化与磷酸酯酶催化的去磷酸化之间失衡所致［20］。GSK-3β是神经系统中催化tau蛋白磷酸化的三大蛋白激酶之一［21］，在脑组织中含量丰富。当GSK-3β被过度激活，可催化一些参与调节tau蛋白微管结合活性的过度磷酸化位点如Ser396、Thr231［22-24］等。异常过度磷酸化的tau蛋白一方面失去催化微管装配、稳定微管结构的生物效能，抑制tau蛋白与微管的结合，使正常细胞骨架结构被破坏，易于聚集成直丝或双螺旋细丝(PHF)进一步缠绕形成NFT［25］;另一方面获得崩解微管的毒性作用，引起胞体与轴突树突之间的APP运输障碍［26］，使得神经元突起末端的神经元发生退行性病变［27］，导致Aβ沉积形成SP，最终与NFT共同促成AD的发生。

4 结论

本次研究结果显示，在AD发病早期以艾灸任督二脉“补肾温阳，益智通髓”的方法干预治疗，能在一定程度上保护AD大鼠的学习记忆，可能是通过抑制GSK-3β活性，进而降低tau蛋白在Thr231、Ser396位点磷酸化水平的途径来达到防治AD的效果。

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Effects of Moxibustion on the Alzheimer Disease Rat Models’Learning and Memory，GSK-3 Beta and Tau Protein Phosphorylation

WANG Jing-rong1，ZHANG Yu-jie1，JIANG Mei-chi1，LIANG Jing2，XU Jian-yang2△，HUANG Han-chang3，JIANG Zhao-feng3
(1．Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;2．General Hospital of armed police forces Beijing 100039，China; 3．College of Applied and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China)

Objective To study the effect and mechanism of moxibustion for prevention and treatment of Alzheimer’s Disease(AD)．Methods:After making the AD model rats with a pair of lateral ventricle injection of STZ，we observe the rats’learning and memory by using Morris water maze，the activity of GSK-3 beta in rats hippocampus by ELISA and Tau protein phosphorylation sites(Ser396/Thr231)of content and expression by immunohistochemistry and Western blot technology．Results:The average swimming distance percentage of moxibustion group are more than model group; hippocampus CA1 in model group district vertebral body immune of staining shows cell form exception，positive cell staining deep while in two a treatment group cell form structure more full and positive staining shallower;GSK-3 Beta activity and the phosphate of Tau protein Ser396，thr231 bit points relative expression volume compared:while the model rose to the highest，control group decline below the moxibustion group and the moxibustion below the model．Conclusion:Moxibustion may partly improve learning and memory in AD rats，possibly through inhibition of hippocampal GSK-3β activities，decreased the phosphorylation of phosphorylation levels of Tau protein site Ser396/Thr231 so as to control AD．

Alzheimer disease;Moxibustion;STZ;GSK-3β;Ser396;Thr231

R245．81

B

1006-3250(2015)10-1287-04

2015-03-07

武警总部专项课题(2011003)

王静蓉(1989-)，女，云南芒市人，医学硕士，从事针灸中药对脑功能的临床与研究。

许建阳(1962-)，男，医学博士后，博士研究生导师，从事针灸中药对脑功能的临床与研究，E-mail:xujianyang @sina．com。