萘普生酶法拆分的研究进展

李海艳，辛嘉英，王艳，王喜军，马杰，邢志华

1.哈尔滨商业大学 食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈药集团制药总厂，黑龙江 哈尔滨 150086

萘普生［naproxen，化学名为2-（6-甲氧基-2-萘基）丙酸］，是一种2-芳基丙酸类非甾体抗炎药物。具有解热、消炎、镇痛的作用，主要治疗风湿性脊椎炎、类风湿性关节炎及产后、术后止痛等，在临床上应用广泛。研究证明，萘普生存在一对光学活性对映体，（S）-萘普生的药效是（R）-萘普生的28 倍，且（R）-萘普生与辅酶A 会形成酯，扰乱人体正常的膜功能及脂代谢等，给人体带来一定的毒副作用。因此，为了用药安全，在临床上须使用纯S型萘普生。所以，研究一种高效、低成本拆分萘普生的方法就变得非常重要[1-4]。

目前，外消旋萘普生的主要拆分方法有诱导结晶法、化学拆分法、色谱法、酶促拆分法等[5-6]。诱导结晶法步骤繁琐，操作条件不易控制，单程收率较低，且易因对映体浓度增加而导致夹带析出的现象；化学拆分法一直存在拆分剂筛选上的盲目性，采用的手性拆分试剂昂贵且消耗量大，生产成本较高并且会对环境造成污染；色谱法成本高，且主要用于分析与小规模制备，很难实现工业化[5-7]；酶促拆分技术因其具有选择专一性强、反应速度快、反应条件温和、可降解无污染等优点，受到了极大的关注[8-12]。在此，我们从酶的选择、酶的固定化及反应体系的构建方面对萘普生的酶法拆分做简要介绍。

1 酶的选择

利用生物酶高选择性催化萘普生拆分研究取得了较好的效果，但迄今为止发现的可高选择性拆分外消旋萘普生的脂肪酶种类较少，其中，偏好S型异构体的假丝酵母脂肪酶最常用。Sema 等应用假丝酵母脂肪酶CRL进行外消旋萘普生甲酯对映体的选择性水解，在120个大气压、37℃下反应2 h，获得了最高的对映体比率，产物的对映体过量值eep=97.9%、底物的对映体过量值ees=68.8%时，对映体比率值E=193[13]。Eun 等用两步丙酮处理的假丝酵母脂肪酶CRL 对外消旋萘普生甲酯进行选择性水解，就水解反应速率和对映体选择性来说，最适反应条件为37℃、pH6.0，经过156 h的反应后，38.4%的（R，S）-萘普生甲酯被水解了，表现出98%的对映体过量值，对映体比率值E＞100。最终，（S）-萘普生被从反应混合物中分离出来，其光学纯度达到98%，回收收益率达95%[14]。为了改变这种用酶单一的情况，近年来，研究人员积极开发其他种类的酶。Morrone等对南极假丝酵母脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶等5 种脂肪酶进行了筛选，发现只有南极假丝酵母脂肪酶Novozym 435显示所需R型异构体，并利用Novozym 435进行不可逆的酯化反应，这一过程提供了萘普生的拆分，S型萘普生的对映体过量值达到了98%，产率为52%[15]。Lucia 等对适用于（R，S）-萘普生的对映体拆分的酯酶和脂肪酶进行了筛选并对活性进行了鉴别，通过统计学设计的实验，从8种可行的商业化酶中选取（S）-萘普生对映体过量值大于98%、外消旋物底物转化率大于40%、对映体比率值E＞100 的可用于优化对映体选择性的酶，结果显示来源于ChiroCLEC-CR 和ESL001-01 的脂肪酶提供了较好的对映体过量值，但只有ChiroCLEC-CR 脂肪酶对对映体比率E 具有特异性[16]。Cheng 等发现蕴含在粗木瓜蛋白酶中的番木瓜脂肪酶CPL，能够在饱和（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯水溶液中对其进行生物催化，使得进行对映体选择性水解。研究发现，在异辛烷中得到最大起始速率的温度是60℃，这时脂肪酶具有很高的对映体选择活性，对映体比率值E=122。对比番木瓜脂肪酶CPL 和细菌脂肪酶的酶活表现，结果表明，对于（S）-萘普生，番木瓜脂肪酶CPL 的对映体选择性和活性更好，在60℃的异辛烷饱和水溶液中也更加稳定[17]。而Liu 等从枯草芽孢杆菌ECU0554 中提出了（S）-对映体酯酶，命名为BsENP01，已在异源宿主大肠杆菌BL21中被克隆和过表达。BSE-NP01是相对分子质量约32 000的羧酸酯酶，最适温度和pH 值分别为50℃和8.5。它可以催化外消旋的萘普生甲酯选择性水解（S）-对映体，得到（S）-萘普生对映体过量值为98%，在2 L规模的固体-水两相系统中重复批量生产（S）-萘普生，在10 次完整的回收（R）-底物之后，平均总收率达85%[18]。Lucia 等使用异源表达的羧基酯酶NP 水解外消旋萘普生甲酯，在每克底物添加10单位酶的条件下，5 h 内转换率可达46.9%，产物的对映体过量值可达99%，对映体比率值E约为500[19]。

2 酶的固定化

为了提高酶的选择性，保持酶的活性及稳定性，便于酶的重复利用[20]，经常应用的方法就是对酶进行固定化。崔玉敏等以中等极性大孔吸附树脂HZ-806 作为固定化载体，利用柱状假丝酵母脂肪酶选择性催化（S）-萘普生酯发生水解，在中等极性大孔吸附树脂固定化酶填充床反应器中，连续水解拆分混旋乙氧基乙基萘普生酯，当流量为72 mL/h时，酯的水解率为17%，光学纯度为89.1%[21]。Lin 等用固定在聚丙烯粉末上的皱褶念珠菌脂肪酶在45℃的异辛烷中对（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯进行对映体选择性水解的生物催化过程，外消旋物底物转换率为95.5%时，得到了较低的产物对映体过量值（eep=58.1%）。这也许是因碱的外消旋作用能力的减弱和非酶水解作用的增强所致[22]。Elif 等发现来源于石松的天然多聚物孢子花粉素具有稳定的化学结构，对于化学攻击具有非常高的抗性。将假丝酵母脂肪酶CRL 用化学惰性的溶胶-凝胶四乙氧基硅烷（TEOS）和辛基三乙氧基硅烷（OTES）包裹，对外消旋萘普生甲酯进行水解，结果表明，以孢子花粉素为基础的封装脂肪酶相较于无溶胶-凝胶包裹的脂肪酶，具有特别高的转化率和对映选择性，对映体比率值E＞400，（S）-萘普生的光学纯度达98%[23]。Serpil等将假丝酵母脂肪酶CRL固定于大网状树脂上，测定最佳水解外消旋萘普生甲酯的反应条件。最佳的转化率和对映体选择性的条件是45℃、pH6，成功应用于180 h 的连续批处理运行中，在转化率达到49%时取得了最高的对映体比率值E为174.2[24]。

近年来还有研究人员使用溶胶-凝胶的方法对脂肪酶进行封装。与其他固定矩阵相比，溶胶-凝胶法没有任何共价修饰，特别容易制备。它还具有几个优势：可以截留大量的酶，具有化学稳定性和热稳定性，在手性芳香醇、羧酸和羧酸胺动力学拆分中是一种优秀的催化剂。Elif 等将假丝酵母脂肪酶CRL通过共价键合或者溶胶-凝胶封装过程固定在戊二醛活化的氨基玻璃球上，在水相缓冲液/异辛烷反应系统中对外消旋萘普生甲酯进行对映体选择性水解，相较于共价固定化的脂肪酶，包入胶囊的玻璃球的脂肪酶对映体选择活性要高，且显示出优异的对映体选择性（E＞400），胶囊包裹脂肪酶的（S）-萘普生对映体过量值为98%，且包入胶囊的脂肪酶的活性比率达到了166.9，这比共价固定化的脂肪酶要高5.5倍[25]。Serkan等通过缩聚四乙氧基硅烷和正辛基三乙氧基硅烷将CRL 封装在化学惰性溶胶-凝胶中，用于外消旋萘普生甲酯的对映体选择性水解反应，并与游离脂肪酶和共价固定化的脂肪酶进行比较。结果表明，该封装脂肪酶在动力学拆分（R/S）萘普生甲酯的最适pH 值和温度分别为7.0 和55℃，且具有良好的稳定性、适应性和可重用性[26]。Elif同样将褶皱假丝酵母脂肪酶用溶胶-凝胶的方法封装，将5，11，17，23-四叔丁醇-25，27-二（2-氨基吡啶）羰基甲氧基-26，28-二羟基环[4]芳基连接到磁性Fe3O4纳米粒子（Calix-M-E），对这一封装脂肪酶的催化活性进行外消旋的萘普生甲酯的对映选择性水解试验。相比于没有载体包封的脂肪酶（E=137），Calix-M-E 有很大的催化活性和对映选择性（E=400），以及显著的可重用性[27]。Enise观察到，将CRL用环[n]芳基羧酸衍生物封装，Fe3O4作为添加剂，进行外消旋萘普生甲酯对映体选择性水解反应，pH7.0、35℃是最有效的水解条件，转化率及对映体比率值E 分别能达到49%和525。除封装脂肪酶的可重复性和可恢复性之外，酶的负担能力也很重要[28]。Elif等将β-环糊精连接到磁性纳米颗粒上，和褶皱假丝酵母脂肪酶一起被封装到用烷氧基硅烷前体制作的溶胶-凝胶模型中。在水缓冲溶液/异辛烷反应体系中对外消旋萘普生甲酯进行对映体选择性水解，用磁性β-环糊精封装的脂肪酶被观察到优异的对映体选择性（E=399），（S）-萘普生的对映体过量值能达到98%[29]。Serkan 等将2 种类型的纳米颗粒作为添加剂用于皱褶假丝酵母脂肪酶的包被，包被用了溶胶-凝胶法。第一种方法，纳米粒子共价连接新合成的环[8]芳基八面体戊酸衍生物（C[8]-C4-COOH）产生新的环[8]芳烃装饰磁铁矿纳米颗粒（NP-C[8]-C4-COOH），然后NP-C[8]-C4-COOH被作为添加剂使用在溶胶-凝胶包封过程中；另一种方法，氧化铁纳米粒子被直接添加到溶胶-凝胶封装过程，与C[8]-C4-COOH和褶皱假丝酵母脂肪酶以静电相互作用。对2 个新型封装脂肪酶（Enc-NP-C[8]-C4-COOH和Enc-C[8]-C4-COOH@Fe3O4）在外消旋萘普生甲酯水解反应中的催化活性和对映体选择性进行了评估，结果表明，当脂肪酶被封装在基于环芳烃的添加剂的存在下，脂肪酶的活性和对映选择性得到改善。的确，同自由脂肪酶（E=137）相比，封装脂肪酶具有优秀的对映体选择性，E 分别为371 和265。在重复使用5次之后，Enc-C[8]-C4-COOH@Fe3O4保留其初始活性的86%以上，而NP-C[8]-C4-COOH则可达到92%以上[30]。Ezgi 等合成了2 种新的低取代环[4]芳烃二酰胺衍生物（5 和6），使用它们在溶胶-凝胶封装技术固定CRL，并对2个新包封的脂肪酶5-CRL 和6-CRL 的（R，S）-萘普生甲酯的水解动力学拆分的活动进行了评价，（R，S）-萘普生甲酯的对映选择性显著改善，分别具有392和525的对映体比率。此外，与没有载体的自由脂肪酶相比，5-CRL和6-CRL 还具有快速恢复的能力[31]。Enise 等将皱褶假丝酵母脂肪酶包封在溶胶-凝胶中，以环[4]芳烃肼或羧酸衍生物和Fe3O4磁性纳米粒子作为添加剂。将包封的脂肪酶用于外消旋萘普生甲酯的对映选择性水解反应，发现其具有优良的活性和对映选择性（E＞300）[32]。

3 反应体系的构建

酶法拆分萘普生，一般思路是先把外消旋萘普生转化为外消旋萘普生酯，再利用酶高选择性地将（S）-萘普生酯水解成（S）-萘普生，从而达到拆分的目的。研究人员想找到一种具有较高极性并可长期保持酶活性的溶剂，以保证反应底物萘普生酯在反应体系中有较高的溶解度，脂肪酶在催化拆分外消旋萘普生时表现出良好的酶促转化效率。Hernáiz等发现在水解（R，S）-2-芳基丙酸乙酯时使用橄榄油作为基质，相对于无外部阳离子条件，有二价和/或一价阳离子（Na+或Ca2+）时会增加脂肪酶活性[33]。María 等使用商业化粗酶（LC）及半纯化的念珠菌假丝酵母脂肪酶（LS），对（R，S）-2-芳基丙酸酯进行对映选择性水解，并在反应体系中加入乳糖（24 h），发现2 种酶同时增加活性，但半纯化的脂肪酶活性更高[34]。Xin 等使用光分解的甲醇对萘普生甲酯的对映体进行选择性水解，甲醇被光催化生成水，酯催化水解的平衡常数（K）会被改变。平衡获得量和对映体过量值会被升高。因为脂肪酶不会在有机溶剂中溶解，它被吸附在光催化剂颗粒上，这可能促进酶从反应系统中隔离出来[35]。周彩荣等用氢氧化钠水溶液水解2-甲氧基-6-（2'-萘基）丙酸-（2″，2″-二甲基-3″-溴）丙酯得到萘普生，在水解温度（110±5）℃、水解反应时间60～90 min、w（NaOH）=40%、n（氢氧化钠）∶n（原料）=4.4∶1 的条件下，萘普生收率可达99.19%[36]。鞠培培等、赵永杰等分别利用拟低共熔体系及离子液-水体系，不同程度地提高了水解拆分反应效率，与传统有机溶剂体系相比，此2种体系均对环境友好[37-38]。Dean等在生物催化反应中添加聚乙二醇（PEG）1000 作为共溶剂，能够将转化率提升10 倍，最佳反应条件是底物浓度为10%（m/v）、酶和底物的比率为1:50、50℃、pH5、添加41%的PEG 1000。尽管动力学得到了改善，但在这些条件下的生物催化活性不高，限制了能够循环的次数[39]。Chen 等在饱和水溶液中利用海氏番木瓜的粗脂肪酶对（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯的对映体选择性生物催化水解，将该酶的表现与番木瓜脂肪酶进行对比，2 种脂肪酶都表现出了对亲水性溶剂的较低耐受性，同时它们的活性也能被（S）-萘普生2，2，2-三氟代乙醇抑制，2 种部分纯化脂肪酶都可使酶活性和对映体选择性得到改善[40]。Giorno 等研究了-OR酯基长度对催化剂活性和游离酶对映体选择性的影响，发现酶的对应体选择性及活性与-OR 基团中碳原子的数量逆相关，对于固定化酶来说这意味着对一个生产体系合适底物进行选择取决于目的产物的纯度和对映体旋光性之间的平衡[41]。辛嘉英等利用选择性相反的2种脂肪酶对外消旋萘普生甲酯进行选择性拆分，制备高光学纯度（S）-萘普生。先利用R选择性的固定化南极假丝酵母脂肪酶Novozym 435对外消旋萘普生甲酯进行第一次拆分，然后用S选择性的固定化南极褶皱假丝酵母脂肪酶CRL对S过量的剩余底物萘普生甲酯在同样的反应体系中进行第二次拆分，最后得到对映体过量值为96.8%的（S）-萘普生，产率达19.9%[42]。

4 结语

萘普生的酶法拆分既有优点，又有许多不足之处，如酶的处理、拆分剂及拆分体系的选择，拆分过程的热力学及动力学研究等，都还需要进一步探索。但可以预见，伴随着生物技术的迅速发展，以及近年酶法的不断进步，人们对各种对映体拆分机制更为深入的研究，酶法拆分技术必将更加完善。

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