苹果牛眼果腐病菌3个致病种LAMP检测方法的建立

李鑫，黑多尔，刘岩，张寅寅

辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001

苹果牛眼果腐病（bull's eye rot on apple）由明孢盘菌属的3个致病种（Neofabraea perennans、N.malicorticis、N.alba）引起[1]，是我国对外一类检疫对象[2]。苹果牛眼果腐病主要依靠进境水果传播蔓延，目前对苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定，一般采用常规PCR 和测序同时进行判定[3]，虽然准确率较高，但整个检测周期最少在10 d 左右，有时甚至长达20 d，而根据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》[4]规定，进境货物在实验室出具检验检疫结果之前，该批货物不得销售、使用，因此，较长的检测周期严重影响了货物的通关速度，甚至会给货主带来不必要的经济损失。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是近年发展迅速的一种快速检测方法，其相较于PCR 的最大优势在于检测时间大大缩短，检测结果肉眼可见，检测特异性提高2 个数量级，且扩增阶段对仪器要求低[5]。因此，研发适用于苹果牛眼果腐病菌3 个致病种的LAMP检测法，实用方便，可应用推广于检测一线，并能很好地解决快速通关与提高检出率并行的难题。

1 材料与方法

1.1 材料

N.perennans（ATCC26206）和N.malicorticis（ATCC13903）购自美国菌种保藏中心（ATCC）；N.alba由广东检验检疫局技术中心王卫芳研究员馈赠。

LAMP DNA 扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；DNA提取试剂盒为Omega微量DNA提取试剂盒；其余普通分子生物学试剂均购自大连宝生物公司。LAMP实时浊度仪为日本荣研LA-320c。

1.2 明孢盘菌属3个致病种LAMP通用引物设计

LAMP 引物设计主要针对靶基因的6 个不同区域，即基于靶基因3'端的F3c、F2c 和Flc 区及5'端的Bl、B2和B3区等6个不同位点设计4种引物。

本研究根据明孢盘菌属特异性β-tublin基因和真菌通用引物ITS序列作为靶序列进行引物设计。

1.3 最佳引物筛选

1.3.1 LAMP 反应体系的配制 1 次反应量反应体系包括：2×反应缓冲液12.5 μL，引物FIP 1.0 μL（40 pmol）、BIP 1.0 μL（40 pmol）、F3 1.0 μL（5 pmol）、B3 1.0 μL（5 pmol），BstDNA 聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去离子水5.5 μL，总体积25.0 μL。分装入另行准备的预混溶液配制用灭菌管中（在冰上进行）。

向Loopamp（R）反应试管中分别加入上述样本反应及对照反应所需的预混溶液各23 μL，添加模板DNA 2 μL，使总量达25 μL；阴性对照反应用去离子水2 μL代替样品DNA。

1.3.2 阳性对照反应 使用阳性对照DNA（PC DNA）2 μL。用移液器吸排液法将2×反应缓冲液12.5 μL、引物溶液DNA 2.5 μL、BstDNA 聚合酶1.0 μL、阳性对照DNA2.0 μL、去离子水7.0 μL（总体积25.0 μL）混合，或合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心。混合时注意不要产生气泡。预混溶液和样本溶液的混合在冰上进行。

1.3.3 反应条件 将已配制好、分装完毕的反应试管置于LA-320C实时浊度仪（已与电脑连接）中，根据仪器操作说明书设定反应条件：65℃恒温30～60 min，80℃恒温5 min 或95℃恒温2 min，使酶灭活以终止反应。

1.4 特异性引物反应最佳温度的筛选

采用上述得到的特异性引物，在相同体系条件下进行LAMP最佳温度筛选试验。反应体系及操作步骤同1.3，设计梯度温度依次为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，其他反应条件不变，根据扩增效率筛选出引物反应的最佳温度。

2 结果

2.1 引物设计结果

根据β-tublin基因设计出2 组引物组合①、②，根据ITS 序列设计出1 组引物组合③。每组引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP，灰底突显为差异基因。

引物组合①：

引物组合②：

引物组合③：

2.2 LAMP法最佳特异性引物的筛选结果

将设计的3 组引物分别与3 个DNA 样品进行LAMP反应，分别设置阳性对照及阴性对照。

2.2.1 引物组合①扩增结果 试验结果表明阳性对照有扩增，而本研究中所采用的引物组合①对目标菌均无特异性扩增，表明该引物组合对明孢盘菌属真菌的无特异性（图1）。

2.2.2 引物组合②扩增结果 从图2 可看出，除阳性对照外，N.alba有扩增，其余参试菌株无扩增，表明该引物组合不适合作为明孢盘菌属真菌的特异性引物。

2.2.3 引物组合③扩增结果 LAMP 验证试验表明引物组合③可以特异性扩增出N.malicorticis、N.perennans、N.alba这3 种参试目标菌株，且阳性对照正常有扩增，阴性对照无特异性扩增，表明该引物组合针对明孢盘菌属3个致病种的特异性较好（图3）。

图1 引物组合①扩增结果

图2 引物组合②扩增结果

2.2.4 特异性引物反应最佳温度筛选 以N.alba种DNA 作为靶序列，进行LAMP 反应最佳温度梯度实验，6 条扩增曲线见图4。结果表明，当扩增温度逐渐升高时，扩增效率随之升高，当扩增温度达到64℃时，温度的增加并未对扩增效率有明显影响，因此，将64℃作为最佳反应温度。

图3 引物组合③扩增结果

图4 不同温度下的扩增效率

3 讨论

苹果牛眼果腐病在欧美苹果产区存在历史长达百年，此病有“苹果树癌症”之称，一旦发生很难控制。2009年，我国广东口岸首次截获该病菌[6]，之前在国内未见相关报道。针对该病的检疫鉴定方法多采用真菌通用引物扩增后测序的方式，检测周期颇为漫长。2012年，笔者曾针对引起苹果牛眼果腐病菌的3 个致病种研发了其通用引物，经验证特异性较好[3]。此次，本研究再次针对该病的3个致病种进行LAMP引物的设计，旨在建立更高效、特异的适用于口岸检测的LAMP 检测方法。验证试验结果表明，通过真菌通用引物ITS序列设计的LAMP引物组合③，对明孢盘菌属的3 个致病种可产生特异性的扩增，且最佳反应温度为64℃。

本研究建立的LAMP检测苹果牛眼果腐病菌的技术，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点。该方法的研发简化了苹果牛眼果腐病的检验检疫过程，提高了通关效率，为缩短检测时限创造了良好的理论基础。

[1]Henriquez J L,Sugar D.Etiology of bull's eye rot of pear caused by Neofabraea spp.in Oregon,Washington,and California[J].Plant Dis,2004,88:1134-1138.

[2]中华人民共和国农业部、质检总局.中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录[Z].2007-05-28.

[3]李鑫,曹际娟,王有福,等.PCR 检测引发苹果牛眼果腐病的明孢盘菌属的三个致病种[J].植物检疫,2013,27(3):75-79.

[4]全国人大常委会.中华人民共和国进出境动植物检疫法[Z].1991-10-30.

[5]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.

[6]王卫芳,胡佳,张永瑜,等.广东口岸首次截获美国苹果牛眼果腐病[J].植物检疫,2010,24(1):35-37.