炼油废水中异养硝化-好氧反硝化菌的筛选

武文丽，颜家保，纪南南，曹晓诗，胡茜茜，吴 优

（武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）

炼油废水中异养硝化-好氧反硝化菌的筛选

武文丽，颜家保，纪南南，曹晓诗，胡茜茜，吴 优

（武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）

从炼油废水活性污泥中筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6。对筛选菌株进行了生理生化实验和菌种鉴定，考察了碳源种类、培养基的m（C）∶m（N）、培养温度、初始pH及接种量对菌株硝化性能的影响；并对其NH3-N去除性能进行了考察。经鉴定，该菌为鲍曼不动杆菌，适宜的培养条件为：以丁二酸钠为碳源、培养温度30℃、初始pH 9.0、m（C）∶m（N）=10、接种量2.0%。在此条件下培养20 h，可将NH3-N质量浓度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率为11.79 mg/（L·h）。WY6菌可在32 h内将实际炼油废水的NH3-N质量浓度由初始时的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率达98.4%，表现出良好的应用前景。

炼油废水；氨氮；异养硝化-好氧反硝化；菌种筛选

炼油废水含有烃类化合物及其衍生物、酚类、杂环化合物、硫化物和氨氮等多种污染物，废水量大，组分复杂，难降解有机物多，COD含量较高［1］。炼油废水一般采用隔油—气浮—生化的处理工艺［2］，COD去除效果较好，但废水中NH3-N的脱除效果常常不稳定，生化过程硝化率低，造成生化后出水ρ（NH3-N）超标，不得不增加生物接触氧化池和生物曝气滤池等装置进一步处理，提高了废水的处理成本。炼油废水生物处理系统的硝化率较低有多方面原因，最主要的可能是某些毒性有机物对自养硝化菌的抑制。而异养硝化菌能利用有机碳源，可消除有机物的抑制作用，从而提高炼油废水的硝化效果，并达到同时脱碳脱氮的目的。

本工作从炼油废水生物处理活性污泥中分离得到异养硝化-好氧反硝化高效菌，对筛选菌株进行了生理生化实验和菌种鉴定，考察了碳源种类、培养基的m（C）∶m（N）、培养温度、初始pH及接种量对菌株硝化性能的影响；并对其NH3-N去除性能进行了考察，旨在为炼油废水的新型生物脱氮技术提供依据。

1 实验方法

1.1 材料和仪器

活性污泥：取自中国石化武汉分公司炼油废水生化处理装置。

LB培养基：酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蛋白胨10 g，pH=7.1～7.5，加蒸馏水定容至1 L。

异养硝化培养基：丁二酸钠9.54 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO40.1 g，FeSO40.01 g，微量元素储备液2 mL，pH=7.0～7.3，用蒸馏水定容至1 L。

微量元素储备液：组成见文献［3］。

反硝化培养基：用0.15 g KNO3替代（NH4）2SO4，其余组分同异养硝化培养基。

实际废水：中国石化武汉分公司排水车间气浮隔油后的炼油废水，COD=600～800 mg/L，ρ（NH3-N）=60～80 mg/L，pH=8～9。

所用试剂除酵母提取物、蛋白胨外，其余均为分析纯。

SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司；QYC21型恒温摇床：上海福玛实验设备有限公司；752N型紫外-可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；1-14型小型离心机：德国SIGMA公司。SA3500-85型双目显微镜：北京泰克仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 异养硝化-好氧反硝化菌的富集和筛选

取少量活性污泥接种于LB培养基中活化，然后转接至异养硝化培养基中多次驯化，对驯化后的菌液进行梯度稀释，采用平板划线法进行纯化，得到异养硝化菌株；对筛选出的菌株进行硝化性能测试，将硝化能力较好的菌株再接种至好氧反硝化培养基中多次驯化，再经分离纯化得到同时具有异养硝化和好氧反硝化能力的菌株。

1.2.2 菌种鉴定

选取筛选得到的异养硝化-好氧反硝化性能最好的一株细菌作为高效菌，进行菌种鉴定和特性研究：依据《常见细菌系统鉴定手册》［4］进行形态学观察和生理生化试验；用溶菌酶-CTAB-蛋白酶K法［5］提取DNA，委托北京鼎国生物技术有限公司进行16S rDNA序列分析。

1.2.3 培养条件的选择

将筛选所得高效菌接入LB培养基中，在培养温度30 ℃、摇床转速150 r/min的条件下培养，取对数生长期的菌液离心，收集菌体，再用无菌水洗涤2次，然后将菌体重悬浮于无菌水中，调节菌体浓度，使菌液于600 nm处的光密度约等于1，制成菌悬液，4 ℃保存备用。

将菌悬液按一定接种量（φ，%）接种至以NH3-N为唯一氮源的异养硝化培养基中，ρ（NH3-N）=212.02 mg/L，在摇床转速150 r/min的条件下培养，分别考察碳源种类、m（C）∶m（N）、培养温度、初始pH及接种量对菌株硝化性能的影响。

1.2.4 炼油废水中NH3-N的降解

将筛选得到的异养硝化-好氧反硝化菌按一定接种量接种于100 mL气浮后的实际炼油废水中，考察菌株在最佳培养条件下对实际废水中NH3-N的去除效果。

1.3 分析方法

细菌生长量采用光密度法测定［6］；ρ（NH3-N）采用纳氏试剂分光光度法测定［7］。

2 结果与讨论

2.1 菌种鉴定

经分离纯化，获得12株同时具有异养硝化和好氧反硝化能力的菌株。选取1株硝化和反硝化综合性能最好的菌株（命名为WY6）进行研究。在异养硝化固体培养基上，WY6菌落呈乳白色，圆形，中间凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，无水溶性色素产生，革兰氏染色呈阴性。该菌不能水解淀粉和明胶，产生H2S；甲基红反应呈阳性，而二乙酰反应、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产酸实验呈阴性。WY6菌的菌落形态和革兰氏染色菌体的显微镜照片见图1。

菌株WY6通过16S rDNA测序后，将所得碱基序列在GenBank数据库中进行比对，并用MEGA 5.0软件计算序列的系统进化距离，构建菌株WY6的系统发育树，见图2。由图2可见，在进化过程中与菌株WY6亲缘关系最近的均为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。结合WY6的形态学特征、生理生化特征，将其鉴定为鲍曼不动杆菌。

图1 WY6菌的菌落形态（a）和革兰氏染色菌体（b）的显微镜照片

图2 菌株WY6的系统发育树

2.2 培养条件

2.2.1 碳源

WY6为异养硝化菌，可以利用培养基或废水中的有机碳源。在m（C）∶m（N）=8、培养温度为30 ℃、初始pH为7.1、接种量为2.0%的条件下，将WY6分别接种至以葡萄糖、蔗糖、乳糖、丁二酸钠和柠檬酸钠为碳源的异养硝化培养基中，考察碳源种类对NH3-N去除效果的影响。碳源种类对ρ（NH3-N）的影响见图3。由图3可见：分别以丁二酸钠和柠檬酸钠为碳源时，ρ（NH3-N）下降速率最快，以蔗糖为碳源时居中，以葡萄糖、乳糖为碳源时最慢；当以丁二酸钠为碳源、培养时间为26 h时，ρ（NH3-N）由212.02 mg/L 降至8.52 mg/L。这可能是因为WY6菌能直接利用丁二酸钠和柠檬酸钠，而以葡萄糖、乳糖为碳源时，还原性糖与氨类物质在高压蒸汽灭菌时会在高温条件下发生美拉德反应，部分生成难以利用的大分子物质的缘故［8］。因此，WY6菌适宜的碳源为丁二酸钠，这与陈赵芳等［9-10］的研究结果类似。

图3 碳源种类对ρ（NH3-N）的影响

2.2.2 m（C）∶m（N）

Joo等［11］的研究结果表明，m（C）∶m（N） 是影响异养硝化菌NH3-N去除效果的重要因素。在以丁二酸钠为碳源、培养温度为30 ℃、初始pH为7.1、接种量为2.0%的条件下，m（C）∶m（N）对ρ（NH3-N）的影响见图4。由图4可见：m（C）∶m（N）越高，NH3-N去除效果越好，反之则越差；当m（C）∶m（N）大于10时，3条ρ（NH3-N）去除曲线几乎重合。说明有机碳源是WY6菌生长的限制性因素，碳源越丰富越有利于NH3-N的去除。因此在后续实验中，m（C）∶m（N）取为10。

图4 m（C）∶m（N）对ρ（NH3-N）的影响

2.2.3 培养温度

培养温度主要影响微生物酶的活性，从而影响其生长和代谢［12］。在以丁二酸钠为碳源、m（C）∶m（N）=10、初始pH为7.1、接种量为2.0%的条件下，培养温度对ρ（NH3-N）的影响见图5。

图5 培养温度对ρ（NH3-N）的影响

由图5可见：培养温度为20～30 ℃时，随培养温度的升高，NH3-N去除效果变好；当培养温度进一步升高至37 ℃时，NH3-N去除效果变差。这可能是由于酶的活性受到一些抑制，使NH3-N的去除速率放缓。由此可见，WY6菌适宜的培养温度为30 ℃。

2.2.4 接种量

接种量的大小影响细菌在培养基中的生长繁殖速率，采用较大的接种量可以缩短细菌达到对数生长期的时间，但接种量过大容易引起溶氧不足，而且也不经济；相反，接种量过小则会延长细菌的延滞期。在以丁二酸钠为碳源、m（C）∶m（N）= 10、培养温度为30 ℃、初始pH为7.1的条件下，接种量对ρ（NH3-N）的影响见图6。由图6可见，接种量在2.0%～10.0%范围内的NH3-N去除效果相差不大。考虑到方法的经济性，将WY6菌接种量定为2.0%。

图6 接种量对ρ（NH3-N）的影响

2.2.5 初始pH的影响

溶液酸碱度是影响硝化作用的重要因素［13］。在以丁二酸钠为碳源、m（C）∶m（N）=10、培养温度为30 ℃、接种量为2.0%的条件下，初始pH对ρ（NH3-N）的影响见图7。

图7 初始pH对ρ（NH3-N）的影响

由图7可见：初始pH在4.0～9.0范围内时，提高初始pH可加快NH3-N的去除，即弱碱性区间内的NH3-N去除速率较中性及弱酸性区间快，这是由于弱酸性不利于细菌的生长，导致NH3-N的去除速率缓慢；在初始pH为9.0、培养时间为20 h时，ρ（NH3-N）由245.46 mg/L 降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率为11.79 mg/（L·h）。实验结果表明，WY6菌适宜的初始pH与实际废水的pH较为接近，方便该菌的实际应用。

2.3 WY6菌对炼油废水中NH3-N的去除效果

在最佳条件下，WY6菌对炼油废水中NH3-N的去除效果见图8。由图8可见：WY6菌能很快适应实际废水环境，且接种量为0.5%和2.0%时NH3-N的去除效果相当；当接种量为0.5%时，炼油废水经32 h处理后，ρ（NH3-N）由初始时的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率达98.4%。该菌表现出良好的硝化能力和潜在的应用前景。

图8 WY6菌对炼油废水中NH3-N的去除效果

3 结论

a）通过硝化培养基富集、驯化，从炼油活性污泥中筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6，经鉴定为鲍曼不动杆菌。

b）菌株WY6的适宜培养条件为：以丁二酸钠为碳源、培养温度30 ℃、初始pH 9.0、培养基的m（C）∶m（N）=10、接种量2.0%。在此条件下培养20 h，可将NH3-N质量浓度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，NH3-N平均去除速率为11.79 mg/（L·h）。

c）WY6菌对实际炼油废水具有良好的NH3-N去除能力，可在32 h内将NH3-N质量浓度由初始时的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率达98.4%，表现出良好的应用前景。

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（编辑 叶晶菁）

Screening of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Strain from Refinery Wastewater

Wu Wenli，Yan Jiabao，Ji Nannan，Cao Xiaoshi，Hu Xixi，Wu You
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

A heterotrophic nitrif i cation-aerobic denitrif i cation bacteria strain WY6 was isolated from activated sludge in the refinery wastewater treatment system. The WY6 was characterized and identified by physiological and biochemical experiments. The effects on nitrif i cation ability of the strain were studied，such as carbon source，m（C）∶m（N） of the medium，culture temperature，initial pH and inoculation amount. And its NH3-N removal ability was also investigated. The identif i cation results show that WY6 is a strain of Acinetobacter baumannii，and the suitable culture conditions for it are as follows：using sodium succinate as carbon source，culture temperature 30 ℃，initial pH 9.0，m（C）∶m（N）=10，inoculation amount 2.0%. When the ref i nery wastewater has treated under these conditions for 20 h，the NH3-N mass concentration can be decreased from 245.46 mg/L to 9.71 mg/L with 11.79 mg/（L·h） of average ammonia removal speed. After treated for 32 h by strain WY6，the NH3-N mass concentration of the actual ref i nery wastewater can be decreased from73.74 mg/L to 1.15 mg/L with 97.8% of NH3-N removing rate，which shows a good application prospect.

refinery wastewater；ammonia nitrogen；heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；strain screening

X172

A

1006-1878（2015）04-0354-05

2015 - 03 - 18；

2015 - 04 - 29。

武文丽（1990—），女，甘肃省白银市人，硕士生，电话 18971048322，电邮 121135637@qq.com。联系人：颜家保，电话 18062689295，电邮 yanjb9198@126.com。

武汉科技大学研究生创新创业基金重点项目（JCX0006）；武汉科技大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201310488009）。