MBR系统好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鉴定

李晓楼

（四川职业技术学院 建筑与环境工程系，四川 遂宁 629000）

研究报告

MBR系统好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鉴定

李晓楼

（四川职业技术学院 建筑与环境工程系，四川 遂宁 629000）

采用间歇曝气法对MBR系统好氧反硝化菌进行了培养和富集，考察了系统的好氧反硝化效果及其影响因素，并对好氧反硝化菌进行了分离和鉴定。实验结果表明：在DO为2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）为8∶1的条件下，MBR系统好氧反硝化效果较好，COD、氨氮、TN的去除率分别达到90%，90%，62%左右；从系统活性污泥中得到11株好氧反硝化性能较好的好氧反硝化菌，它们属于变形菌门，分别属于不动杆菌属、丛毛单胞菌属、气单胞菌属、假单胞菌属和噬氢菌属。

生物脱氮；膜生物反应器；好氧反硝化菌；菌种鉴定

近年来，国家对水质标准和水处理要求的提高，对生物脱氮技术的发展提出了更高要求。传统生物脱氮技术存在较多不足之处，如硝化菌群增殖速度慢、需进行污泥和硝化液的回流、系统抗冲击能力较弱以及脱氮酸碱度需调节等［1］。

研究发现，在好氧硝化池中常有超出微生物增殖所需的氮的去除，损失的总氮量高达30%［2］。这种好氧过程中的脱氮现象是由好氧反硝化菌引起的。与传统生物脱氮技术相比，好氧反硝化菌脱氮具有以下优点：1）使硝化/反硝化反应在同一个反应器中进行，可大幅减少占地面积和建设资金；2）可减少调节系统pH的化学药剂用量，降低成本；3）好氧反硝化菌在处理过程中更易控制［3］。

目前，在多种生物处理系统中都发现了好氧反硝化过程的存在，如好氧曝气池和SBR系统［4-5］。由于生长条件和竞争等因素限制，好氧反硝化菌不易筛选和富集，而采用生物固定化技术和MBR能够有效地保留和富集好氧反硝化菌［6-7］。通过对生物处理系统中好氧反硝化菌的分离筛选和鉴定，了解系统中好氧反硝化菌的生长条件，有利于调控生物处理系统，保证好氧反硝化过程的顺利进行［8-9］。同时，对好氧反硝化菌的分离筛选有助于强化生物脱氮过程［10］。

本工作采用间歇曝气法对MBR系统好氧反硝化菌进行了培养和富集，考察了系统的好氧反硝化效果及其影响因素，并对好氧反硝化菌进行了分离和鉴定，以期为MBR系统好氧反硝化菌的培养及系统调控提供理论基础和技术支持。

1 实验部分

1.1 试剂、材料和仪器

溴百里酚蓝（BTB）分离培养基：KNO31 g，KH2PO41 g，FeC120.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，丁二酸钠8.5 g，1%（w）BTB无水乙醇溶液1 mL，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

反硝化培养基：KNO31 g，KH2PO41 g，FeCl20.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸钠4.5 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

微量元素溶液：乙二胺四乙酸5.0 g，CaCl20.5 g，ZnSO40.3 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 g，CuSO4·5H2O 0.2 g，CoCl2·6H2O 0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH=6.0。

FM培养液：牛肉膏1.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

DM培养液：Na2HPO4·7H2O 7.9 g，KH2PO41.5 g，KNO30.3 g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

废水：人工配制的模拟废水，主要成分为FM培养液2%（w）、DM培养液3%（w）、实际生活污水（取自四川省遂宁市某生活区）10%（φ）。废水的水质见表1，废水pH控制在6.3～7.5。

活性污泥：取自四川省某污水处理厂污泥浓缩池的好氧污泥，呈絮状，沉降性能良好。

DYCP-34A型琼脂糖水平电泳仪：北京六一仪器厂；CARY300型紫外-可见分光光度计：美国Varina公司；HQ30d型便携式溶氧仪：HACH公司；BS210S型电子天平：美国赛多利斯天平有限公司。

表1 废水的水质 mg/L

1.2 MBR系统运行参数

MBR：自制，采用聚偏氟乙烯（PVDF）纤维实验型膜片制成内径为20 cm、高度约120 cm的圆柱形玻璃容器，有效容积30 L。系统基本运行参数：HRT=12 h，MLSS=6～8 g/L，SRT=20～30 d；DO控制在0.5～5.0 mg/L，通过控制曝气量进行调节；m（C）∶m（N）控制在（3～12）∶1，通过改变Na3C6H5O7·2H2O投加量进行控制。MBR系统的运行参数见表2。

1.3 好氧反硝化菌的培养与富集

采用间歇曝气法对MBR系统中好氧反硝化菌进行培养和富集［11］。该方法利用好氧反硝化菌可同时将O2和NO3-作为电子受体的特性，将好氧、缺氧条件进行转换，能够完全抑制好氧菌和厌氧菌的正常生长，促使好氧反硝化菌在竞争中取得优势地位。经过30 d培养，系统在好氧条件下脱氮效果达到稳定，TN去除率维持在30%～40%。

表2 MBR系统的运行参数

1.4 好氧反硝化菌的筛选

从MBR中取10 mL泥水混合液，与90 mL反硝化培养基混合，置于30 ℃摇床内培养24 h。将活性污泥培养液按一定比例稀释，取适量涂布于BTB分离培养基上，置于30 ℃恒温培养箱内培养48 h。挑取使培养基显色（蓝色）的单菌落至BTB分离培养基上，经5～6次划线纯化分离得纯菌株，于4 ℃保存。

1.5 好氧反硝化菌的鉴定

采用Chelex法提取好氧反硝化菌DNA：取1 mL 37 ℃振荡培养后的菌液于1.5 mL离心管中，以8000 r/min的转速离心1 min，去除上清液，加入1mL Trizol试剂，得DNA提取液。

参照文献［12］报道的方法进行16S rRNA基因的扩增。扩增引物序列为上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增程序为：99 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（共30个循环）；72 ℃延伸10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至深圳华大基因研究院进行16S rRNA基因序列的测定。参照文献［13］报道的方法将16S rRNA基因序列（约700 bp）导入EzTaxon-e基因库进行BLAST比对分析。

1.6 分析方法

按照文献［14］报道的方法进行水质的测定。其中，采用重铬酸钾法测定COD；采用纳氏试剂光度法测定氨氮；采用过硫酸钾氧化—紫外分光光度法测定TN；采用便携式溶解氧仪法测定DO；采用酚二磺酸光度法测定硝酸盐氮；采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定亚硝酸盐氮。

挑取筛选提纯的菌落至LB液体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，将培养液离心，用生理盐水洗涤，分别挑取一环接种至100 mL反硝化培养基中，37 ℃振荡培养24 h。测定反应前后培养基中的硝态氮和亚硝态氮的质量浓度，按下式计算菌株的总脱氮率（η，%）。

η=［ρ（初始硝态氮）-ρ（反应后硝态氮）-ρ（反应后亚硝态氮）］/ρ（初始硝态氮）×100%

2 结果与讨论

2.1 MBR系统的处理效果

MBR系统的处理效果见图1。由图1可见：在30 d的启动期中，COD去除率在前10 d逐渐增加，在11～30 d期间，微生物适应进水水质后，COD去除率逐渐稳定，基本维持在90%左右；氨氮去除率在前16 d内总体呈上升趋势，系统的硝化能力逐步加强，在驯化阶段后期，氨氮去除率趋于稳定，达到90%左右；TN去除率在驯化初期呈现出一定的波动性，23 d后稳定在40%左右，可认为此时好氧反硝化菌落结构已趋于稳定。

图1 MBR系统的处理效果

2.2 DO对好氧反硝化效果的影响

阶段2考察了DO对MBR系统处理效果的影响。由图1可见：当DO为0.5～1.0 mg/L（31～37 d）时，由于DO的不足，造成系统COD、氨氮的去除效果及反硝化效果不佳；随DO的增加，COD、氨氮的去除效果及反硝化效果逐渐提升；当DO为2.0～3.0 mg/L（45～51 d）时，COD、氨氮的去除效果恢复至正常水平，同时反硝化效果达到最优。

DO对MBR系统TN去除率的影响见图2。

图2 DO对MBR系统TN去除率的影响

由图2可见：当DO为0.5～1.0 mg/L时，好氧反硝化效果不佳，TN去除率维持在20%以下；随DO的增加，好氧反硝化效率呈先增后降的趋势；当DO为2.0～3.0 mg/L时，好氧反硝化效率达到最高，TN去除率达40%；DO继续增至3.0～5.0 mg/L时，TN降至34%。

综上所述，DO对好氧反硝化效果影响较大。低DO条件下，细胞活性降低，导致细胞生长率和反硝化率降低，硝酸盐还原酶处于抑制状态。此时，脱氮主要是通过传统缺氧反硝化过程，有利于N2生成［15-16］。高DO条件下，微生物活性增加，聚β-羟基丁酸得以积累而利于快速脱氮，使得好氧反硝化顺利进行［17］。曝气时间过长，好氧反硝化菌体开始衰亡，数量减少，活性降低［18］，从而导致TN去除率出现下降。

2.3 有机碳源对好氧反硝化效果的影响

阶段3考察了m（C）∶m（N）对MBR系统处理效果的影响。由图1可见：随m（C）∶m（N）的增大，COD、氨氮的去除效果未受明显影响，去除率维持在90%左右；好氧反硝化效果随m（C）∶m（N）的增大而逐渐提升，当m（C）∶m（N）增至8∶1（69～74 d）时，好氧反硝化效果提升最为明显。

m（C）∶m（N）对MBR系统TN去除率的影响见图3。由图3可见：好氧反硝化效果随m（C）∶m（N）的增大而逐渐提升，当m（C）∶m（N）增至8∶1时，好氧反硝化效率提高明显，TN去除率达62%左右；m（C）∶m（N）继续增至12∶1，好氧反硝化效率提高不明显，TN去除率升至68%左右。

图3 m（C）∶m（N）对MBR系统TN去除率的影响

综上所述，有机碳源对好氧反硝化过程发挥着重要作用，且m（C）∶m（N）越大反硝化效果越好。这是因为：充足的碳源能够为微生物提供足够的能量，使反硝化作用更彻底；同时，硝酸盐还原酶表达基因调控蛋白FNR对周围电子供体和受体变化敏感，相对较高的m（C）∶m（N）激活了好氧反硝化菌相关反硝化基因的表达［19］；而低m（C）∶m（N）时，碳源快速消耗，碳源的不足造成反硝化过程受阻。

2.4 好氧反硝化菌群的鉴定结果

MBR系统经长期驯化后，活性污泥经分离纯化得到11株好氧反硝化性能较好的细菌，利用基因库比对11株好氧反硝化细菌的16S rRNA基因序列，其中，有11个与已知物种相近的不同序列，且与已知物种序列的相似性达到98%以上，它们属于变形菌门（Proteobacteria），分属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）、气单胞菌属（Aeromonas sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和噬氢菌属（Hydrogenophaga sp.）。本实验11条16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KF984303～KF984313。

11株细菌中，总脱氮率在60%以上的有8株。而一般微生物脱氮的最佳效果也仅为30%（总脱氮率），由此可见，从系统中分离出的好氧反硝化菌具有较好的好氧反硝化性能［20-21］。

李安峰等［7］的研究结果表明，在SBR和MBR系统中分离出的高性能好氧反硝化菌属变形菌门，这与本研究的结果相符。这些好氧反硝化菌在属和种水平上表现出丰富的多样性，它们的存在使得MBR系统好氧反硝化效果得以维持和稳定。同时，不同系统好氧反硝化菌群落结构的差异性也为系统好氧反硝化提供了菌株资源。

3 结论

a）在DO为2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）为8∶1的条件下，MBR系统好氧反硝化效果较好，COD、氨氮、TN的去除率分别达到90%，90%，62%左右。

b）通过对系统活性污泥中好氧反硝化菌的分离和鉴定，得到11株好氧反硝化性能较好的好氧反硝化菌，它们属于变形菌门，分属于不动杆菌属、丛毛单胞菌属、气单胞菌属、假单胞菌属和噬氢菌属。

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（编辑 魏京华）

Aerobic Denitrification Effect of MBR and Identification of Aerobic Denitrlfier

Li Xiaolou
（Architecture and Environmental Engineering Department，Sichuan Vocational and Technical College，Suining Sichuan 629000，China）

Aaerobic denitrlf i ers were cultivated and enriched in MBR system by the method of intermittent aeration. The aerobic denitrif i cation effect of MBR and the affecting factors were studied，and the aerobic denitrlf i ers were separated and identif i ed. The experimental results show that： When DO is 2.0-3.0 mg/L and m（C）∶m（N） is 8∶1，the aerobic denitrif i cation effect of MBR system is good，and the removal rates of COD，NH4+-N and TN are about 90%，90% and 62% respectively；11 strains of aerobic denitrlf i erwith good aerobic denitrif i cation capability are isolated from the MBR activated sludge，which belong to Proteobacteria and are Acinetobacter sp.，Comamonas sp.，Aeromonas sp.，Pseudomonas sp. and Hydrogenophaga sp.，respectively.

biological denitrif i cation；membrane bio-reactor；aerobic denitrlf i er；strain identif i cation

X703

A

1006-1878（2015）04-0339-05

2015 - 03 - 20；

2015 - 06 - 03。

李晓楼（1974—），男，四川省遂宁市人，硕士，副教授，电话 15244943011，电邮 lixiaolou_1234@163.com。