褐藻多糖的分离提取及生理活性研究进展

吴 泽, 魏琦峰, 邱庆庆, 任秀莲

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264200



褐藻多糖的分离提取及生理活性研究进展

吴 泽, 魏琦峰, 邱庆庆, 任秀莲*

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264200

褐藻多糖是海藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉的统称，主要存在于褐藻中。褐藻糖胶作为其主要的生理活性物质，主要由L-岩藻糖和硫酸酯基组成，具有抗氧化、抗凝血、防癌抗肿瘤、抗病毒和消炎等活性。综述了褐藻多糖的提取分离方法和褐藻糖胶的生理活性研究进展，以期为褐藻多糖的应用提供参考。

褐藻多糖；褐藻糖胶；提取分离；生物活性

近年来，从海洋尤其是海藻中提取生物活性物质，用作功能膳食和营养食品的开发引起了人们极大的关注[1]。全球海藻产业每年产值高达55～60亿美元，其中食品产业占据了约50亿美元的市场份额，其余由藻胶、化肥、动物饲料、化妆品和药品产业分摊[2]。海藻多糖是一种广泛应用的高附加值、高活性天然产物，其中又以褐藻多糖为代表。褐藻多糖的提取原料主要有海藻(如褐藻)和海洋棘皮动物(如海胆、海参等)两大类[3]。褐藻在海洋中储量大、可再生，使得褐藻多糖的分离提取、结构测定和生理活性成为目前研究的主要内容[4]。这里所指的褐藻多糖是广义的，狭义范围的褐藻多糖主要由褐藻淀粉、褐藻胶和褐藻糖胶3部分组成，其中褐藻胶是褐藻酸及褐藻酸盐衍生物的统称，代表性物质为褐藻酸钠。褐藻糖胶，别称褐藻多糖硫酸酯(FCSPs)，是一种含有大量L-岩藻糖和硫酸酯基的特殊多糖[5]。褐藻多糖表现出的高生物活性往往是由褐藻糖胶提供的。

由于褐藻糖胶有着广泛的生理活性，在医学等领域有着重要的应用价值。但是由于褐藻糖胶的活性与其分子量、单糖组分、硫酸盐含量和硫酸酯基的组成有关，因此在分离过程中容易造成硫酸盐的损失以及目标化合物结构的转变，褐藻多糖的提取分离方法是制约其广泛应用的瓶颈。本文综述了褐藻多糖的分离提取方法、褐藻糖胶的生理活性等研究现状，以期为褐藻多糖的研发与应用提供参考。

2 褐藻多糖的提取分离现状

2.1 海藻预处理工艺

海藻中褐藻多糖硫酸酯的含量只占少数，在提取过程中为了避免对其他成分的协同提取，预处理工艺很有必要[6]。在水溶液中，海藻的细胞结构容易被水解，通常使用甲醇∶氯仿∶水=4∶2∶1的混合溶液作为预处理溶液，此三相体系可以除去脂质、萜类和酚类物质[7]。生物黄质、酚类物质较易结合在褐藻多糖硫酸酯及褐藻酸盐上，产生协同提取效应，一般采用甲醛对原料进行预处理[8]。乙醛主要用于除去原料中的叶绿素和甘露醇，通常是将乙醛溶于较高浓度的乙醇水溶液中，避免了预处理过程中褐藻多糖硫酸酯的初次提取[9,10]。上述预处理工艺不会破坏目标产物的分子结构，但甲醛可能会引发蛋白质与多酚或者核酸之间的共价键合，产生大分子的复杂物质，这种物质容易与目标产物反应，降低最终得率[11]。

2.2 褐藻多糖的分离提取

褐藻多糖提取的相关研究最早出现在1913年，Kylin[12]对各种海藻采取先酸提后纯化的方法得到了褐藻多糖硫酸酯，主要成分是岩藻糖、甘露醇和海藻酸等物质。早期的FCSPs提取一般都采用稀酸，如乙酸和盐酸进行所谓的初步提取以水解非FCSPs多糖，在不同的研究中具体的提取与纯化方法都经过各自优化有一定不同。传统的褐藻多糖提取法主要有酸提法、水提法和CaCl2法，新近发展的提取方法主要有超声波、微波辅助提取法和酶辅助提取法。

2.2.1 传统提取法 Marais等[13]将43 g褐藻研磨后常温提取，再用含1% CaCl2的0.01 mol/L NaCl在70℃下提取，重复2次后合并提取物。混合物以蒸馏水透析，浓缩至100 mL，得到粗多糖提取物。粗提物随后以乙醇沉淀，离心收集得粗褐藻多糖。纯化后进行成分分析，结果表明，得到的褐藻多糖仅含有L-岩藻糖和硫酸盐。结合甲基化、红外和核磁共振分析，结果表明得到的褐藻多糖中以α-1,3-糖苷键为主，仅有少量的1,4-糖苷键。支链主要存在于α-1,3-糖苷键中3号所在糖单元的2号位上，以岩藻糖残基为主。Duarte等[14]在室温、机械搅拌条件下从海藻粉末中提取褐藻多糖，反应完成后离心，上清液先浓缩再以蒸馏水透析，之后经离心分离得粗多糖。粗多糖以乙醇沉淀，接着用CaCl2处理之后再以氯化十六烷基吡啶(pH 7)沉淀。所得沉淀溶解在3 mol/L的CaCl2溶液中以除去吡啶盐，再以乙醇沉淀。不溶于乙醇的物质悬浮在水中，离心得到水溶性与水不溶性组分，水溶性多糖得率为0.4%(0.5 mol/L NaCl和水透析)，水不溶性多糖经乙二醇双四乙酸(EGTA)(1%，pH 7)、0.5 mol/L NaCl和水透析后又恢复其可溶性，最终得率为0.3%。Cumashi等[15]在85℃条件下以2%的CaCl2从脱脂后的干燥海藻中提取褐藻多糖硫酸酯5 h，得到的清液用塞太弗仑(cetavlon)进行沉淀，之后再以钙盐洗涤掉塞太弗仑盐，碱洗去乙酰化的同时将褐藻多糖硫酸酯转化为硫酸盐。检测所得褐藻多糖硫酸酯的主要成分为岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸及硫酸盐。

Ponce等[16]以狸藻为原料，分别用蒸馏水、2%CaCl2、pH为2的稀盐酸作溶剂提取褐藻多糖硫酸酯。各体系都是先进行常温提取再在70℃条件下提取，所得产品得率和性质相近。分析结果表明，在常温下提取得到的褐藻多糖硫酸酯以L-岩藻糖、半乳糖和硫酸酯基为主；70℃下的提取物以岩藻糖为主，并伴有少量的杂单糖(D-甘露糖、D-半乳糖和D-木糖)和较大量糖醛酸及微量硫酸酯基。常温提取得到的褐藻多糖硫酸酯表现出了较强的抗Ⅰ型、Ⅱ型热疹病毒活性。Hemmingson等[17]以风干的裙带菜叶片(70∶30，w/w)为原料，1%H2SO4(w/w)溶液室温提取2次，每次6 h，每20 g原料中加入1 L H2SO4。过滤后的提取液以NaOH调节至中性，盐以及小分子物质用截留分子量为14 kDa的透析袋除去，再经低压冷冻干燥得褐藻多糖硫酸酯，得率为4.5%。

Li等[18]采用热水提取褐藻多糖硫酸酯，经DEAE琼脂糖胶和CL-6B色谱柱纯化得到6个组分，每个组分均由大量岩藻糖、甘露糖、半乳糖、硫酸酯基和糠醛酸组成，所得多糖的平均分子质量为25～950 kDa。提取在70℃的水浴中进行，所得产物经乙醇沉淀后再经CaCl2进一步除去褐藻酸，最终的褐藻多糖硫酸酯得率为0.78%，硫酸酯基含量18.6%。

Ale等[19]对传统法所涉及的影响因子(温度、时间和酸度)进行了定量考察，原料粉碎后经甲醇∶氯仿∶水=4∶2∶1的溶液预处理以除去色素和酚类化合物。通过响应面优化法确立了各项参数，发现一步提取法在90℃水浴中200 r/min下提取4 h，HCl浓度为0.03 mol/L时所得的FCSPs得率最高，可达7%。所得褐藻多糖硫酸酯的主要组分为岩藻糖、半乳糖及葡萄糖醛酸。提取时间越短，多糖得率越低，岩藻糖含量越高。当HCl浓度高于0.2 mol/L时，温度与时间的增加不利于多糖的多步提取。

2.2.2 新提取方法 相较于传统的酸提、水提醇沉和盐提法，近些年来发展出了更为高效、快速的多糖提取方法。微波法、超声波法和酶辅助提取法都因其各自优点受到了广泛的研究。Rodriguez等[20]以微波辅助提取法提取褐藻多糖硫酸酯。褐藻粉末以1∶25(g∶mL)的料液比加入蒸馏水后置于提取管中，悬浮液在120 psi的压力下辐射提取1 min之后，迅速置于冰水浴冷却，悬浮液经离心后残留物收集备用。上清液加入1%CaCl2后在4℃下静置过夜除去海藻酸盐，离心后上清液以两倍体积乙醇纯化，4℃贮存8 h。乙醇沉淀后的多糖在8 500 r/min、4℃条件下离心15 min得成品。最终，褐藻糖胶得率18.22%，褐藻消化率51.36%，微波酶解后总糖得率27.62%，硫酸根含量21.09%。Quitain等[21]采用微波辅助水热法提取褐藻多糖硫酸酯。先以4 mL/min的超临界CO2流速提取原料中的脂质后，残留物用于提取褐藻多糖硫酸酯。经微波加热降解之后，在140℃左右提取15～60 min得13 kDa的小分子量目标产物，在110℃左右提取得240 kDa的大分子量目标产物，当温度高于160℃之后未提取到褐藻多糖硫酸酯。Kai等[22]采用超临界CO2和微波加热法从裙带菜中提取褐藻多糖硫酸酯和岩藻黄质。在313 K、40 mPa的条件下超临界提取180 min，岩藻黄质提取率可达75%。以微波水热法提取岩藻黄质残留物，在383 K的温度下提取得到大分子量褐藻多糖硫酸酯，在413 K的温度下提取得到小分子量褐藻多糖硫酸酯(5～30 kDa)。Mussatto等[23]采用自水解法从褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯。在180℃的条件下自水解20 min后，褐藻多糖得率最高为16.5%(w/w)。所得多糖的主要组分为岩藻糖和半乳糖(摩尔比70∶30)，硫酸酯基含量高于20%。

3 褐藻糖胶生理活性

3.1 抗凝血和抗氧化活性

褐藻糖胶具有广泛的生理活性，但目前研究最多的还是其强效抗凝血性。许多研究表明，褐藻糖胶的抗凝血性主要与其硫酸酯基的位置、分子量的大小和糖含量有关[24]。Chevolot 等[25]的研究表明硫酸酯基只有存在O-2和O-3位时才能表现出抗凝血活性。一般表现出较高抗凝血活性的褐藻糖胶的分子量在50～100 kDa之间[26]。Cumashi等[15]研究了9类褐藻中提取的褐藻糖胶的抗凝性能。除了奥氏海藻，其余海藻中的多糖都具有大量的2-O-α-D-吡喃葡萄糖基分支结构，并且通过活化部分凝血酶时间(APTT)试验表现出了抗凝血性能。进一步的研究发现，只有L.saccharina、L.digitata、F.serratus、F.distichus和F.evanescens5类海藻中提取的褐藻糖胶表现出了较强的抗凝血酶活性。Chandía等[27]将自由基解聚后的多糖与原多糖的抗凝血性和酶活抑制性进行了比较。凝血酶时间(TT)试验结果表明两者皆有抗凝血性，但解聚后的褐藻糖胶抗凝血活性明显下降。在烟叶中，两者对苯丙氨酸解氨酶、脂肪氧化酶和谷胱甘肽酶的酶活表现出了较强抑制性。Wang等[28]将提取的低分子褐藻糖胶经由阴离子交换色谱进行分级，得到3个组分DF1、DF2和DF3，对各组分的抗凝血及抗氧化活性进行了分析。相较于BHA、BHT及α-生育酚，各组分褐藻糖胶都有更强的超氧游离基清除作用和更低的半数有效浓度(EC50)。羟基自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)值与多糖的浓度密切相关。DFPS及DF1具有较强的还原能力，DF2和DF3的还原能力较低。APTT、凝血酶原时间(PT)和TT试验的结果表明，各组分多糖的抗凝血活性与硫酸酯基的含量有关。Wijesinghe等[29]的研究显示褐藻糖胶能显著延长凝结时间，APTT和TT试验结果表明这与褐藻多糖的用量和时间有关。尾出血试验表明褐藻多糖能将出血时间从900 s延长到1 800 s。

3.2 抗病毒性

褐藻糖胶在生物体内外都有抗病毒性，相较于其他抗病毒药物，在临床医学上褐藻糖胶的毒性要低得多。Hayashi等[30]的研究发现从裙带菜中提取得到的褐藻糖胶具有很强的单纯疱疹Ⅰ型病毒(HSV-1)抑制性。小鼠活体试验结果表明，用5-氟脲吡啶抑制小鼠自身免疫之后，口服褐藻糖胶能显著提高HSV-1细胞的自然杀伤(NK)活性和增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，同时中和抗体的释放也明显增加。Synytsya等[31]对感染了A型禽流感病毒(H5N3和H7N2)的小鼠进行了试验，结果表明褐藻糖胶能抑制病毒复制、促进抗体产出。口服试验显著降低了病毒存活率，中和抗体及免疫球蛋白A迅速增加。Thuy等[32]研究了3种不同种类褐藻糖胶的抗艾滋病毒(HIV)活性。相近的IC50值表明3种多糖具有类似的抗HIV病毒能力，且与硫酸酯基的含量与位置无关。其与HIV病毒一起预培养能阻断HIV进入目标细胞，降低感染风险。Rabanal等[33]以传统酸提法得到少量galactofucans组分，试验发现它是一种较温和的HSV-1及柯萨奇B3病毒(CVB3)抑制剂，其余组分未表现出明显的抗病毒活性。

3.3 抗癌、抗肿瘤活性

癌症是医学界最难治愈的疾病之一，通常用作癌症治疗的药物都有毒性，它不光能杀死癌细胞还可以影响其他正常细胞组织。近年来，褐藻糖胶的抗癌、抗肿瘤活性的研究引起了研究者极大的关注。Roshan等[34]研究了褐藻糖胶对人体肝癌细胞株HepG2的抗癌效果及抗癌机理。褐藻糖胶能够诱发细胞周期进程中的DNA合成后期(G2期)、细胞分裂期(M期)停滞及细胞死亡，同时观察到p53基因和活性氧的增加，抑制了细胞生长。细胞死亡主要是由磷酸化的stat3因子(p-stat 3)的下降引起的。Anastyuk等[35]通过自水解法制得低分子量褐藻糖胶。天然多糖对人体恶性黑色素瘤细胞系SK-MEL-28和SK-MEL-5都表现出了抗癌活性，而低分子量多糖对两系细胞都未表现出细胞增殖抑制活性；在抑制群落形成方面，对SK-MEL-5细胞系未表现出抑制性，但对SK-MEL-28细胞系表现出了与天然多糖相当的抑制性(70%)，这可能是由于硫酸酯基及α-1,4-岩藻糖苷键的存在引起的。Marudhupandi等[36]从小叶喇叭藻中提取得到褐藻糖胶，岩藻糖含量为53%，硫酸酯基含量38%。以人肺腺癌细胞(A549)系为研究对象，发现褐藻糖胶的体外抗癌活性主要与剂量有关，在31.25～500 μg/mL的浓度范围内抗癌活性可达24.9%～75.3%。Vishchuk等[37]从海带和裙带菜中提取褐藻糖胶。研究了它们对人体乳腺癌细胞系T-47D及黑色素瘤细胞系SK-MEL-28的抗肿瘤活性。提取到的2种多糖明显地表现出了抑制肿瘤细胞增殖及群落生成的特性。

3.4 抗菌消炎

大量研究表明褐藻糖胶具有抗菌消炎活性，但是其潜在的抗菌消炎机理还不是特别清楚。Lee等[38]从深海褐藻中提取褐藻糖胶,以斑马鱼为研究模型，结果表明褐藻糖胶能通过抑制NO及活性氧的产出而减轻截尾诱导及脂多糖受激引发的炎症。同时，褐藻糖胶可以保护斑马鱼胚胎免受内毒素的感染。Ko等[39]从深海褐藻中分离得到3个多糖组分，研究结果表明各组分多糖均能抑制脂多糖受激型巨噬细胞(Raw 264.7)中NO的产出，减轻炎症。此种效应主要是通过降低iNOS、COX-2和促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的传递实现的。Park等[40]发现褐藻糖胶能抑制BV2小胶质细胞中由脂多糖(LPS)诱导的NO和前列腺素E2(PGE2)生产过剩，弱化iNOS、COX-2、MCP-1、促炎因子(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的传递。同时，褐藻糖胶还可以抑制核因子(NF-κB)活性，下调细胞外调节蛋白激酶(ERK)、应激活化蛋白激酶(JNK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)的表达。

3.5 其他活性

除上述活性外，褐藻糖胶还有免疫调节、降血脂和降血糖等生理活性。Cho等[41]从孔叶藻中提取褐藻糖胶，离子交换色谱分级后得到F1和F2两个组分。F1组分对RAW 264.7有强烈地刺激作用，可以激活NF-κB、MAPKs途径，从而引发iNOS、COX-2和IL-10的传递提升NO的释放。免疫调节功能最强的的多糖组分主要由1,3-岩藻糖苷键、1,2-甘露糖苷键、1,4-葡萄糖醛酸和硫酸酯基键合在岩藻糖主链的C-2、C-4位上。Cui等[42]的研究表明小分子量的褐藻糖胶可以保护内皮功能、降低糖尿病小鼠血压。Chen等[43]发现褐藻糖胶的摄入可以提升小鼠的运动功能和抗疲劳能力，降低血清水平，提升葡萄糖水平。Huang等[44]的研究显示褐藻糖胶可以显著降低低血脂小鼠中血清总胆固醇、甘油三酸脂和低密度脂蛋白胆固醇，提升高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酰基转移酶的活性。Raghavendran等[45]发现褐藻糖胶对阿司匹林等抗生素药引发的小鼠胃黏膜损伤具有免疫调节功效。Kim等[46]研究了不同分子量褐藻糖胶对Ⅱ型糖尿病的影响，结果表明各分子量多糖均能有效预防餐后血糖上升，降低血糖水平。

4 展望

目前，褐藻多糖的提取方法已经越来越多样化，但更多的还是停留在实验室研究阶段，鉴于其广泛的生理活性和良好的市场前景，开发出具有产业化价值的提取分离方法前景广阔。不同原料、不同方法提取的褐藻多糖往往在生理活性、结构功能上千差万别，如何在提取过程中控制产品纯度、避免结构转化将成为未来研究中的一个热点问题。

褐藻糖胶的活性与其分子量密切相关，为获取小分子量褐藻糖胶，往往需要将所得的粗多糖进一步降解，耗时耗力且损失大，如何在提取过程中实现同步降解具有重要的研究意义。另一方面，褐藻糖胶的生理活性研究目前大多停留在表面，通过特定的一些试验证明相关活性，但进一步的作用机理研究相对较少。随着研究的深入、范围的扩大，褐藻糖胶的活性机理研究势在必行。

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Research Progress of the Extraction Procedures and Bioactivities of Brown Seaweed Polysaccharide

WU Ze,WEI Qi-feng,QIU Qing-qing,REN Xiu-lian*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264200,China

Brown seaweeds polysaccharide usually contains alginate,fucoidan,laminam and mainly exist in brown seaweeds.As the main physiological active substances,fucoidan composes of L-fucose and sulfate groups.Fucoidan has different beneficial biological activities including antioxidant,anticoagulant,anti-cancer,anti-tumor,anti-virus and anti-inflammatory,etc.This paper reviewed the latest research progress of the extraction procedures and bioactivities of fucoidan,which was expected to provided reference for fucoidan application.

brown seaweeds polysaccharide; fucoidan; extraction; bioactivities

2015-05-03; 接受日期：2015-05-14

威海市科技发展计划项目(CTBA02211003)资助。

吴泽，硕士研究生，主要从事天然产物提取分离研究。E-mail:wuze0612@sina.com。*通信作者：任秀莲，教授，博士生导师，主要从事有机酸的提取分离研究。E-mail: renxiulian@126.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.09