产脂肪酶深海细菌的筛选鉴定及酶学性质研究

王 凯, 刘洪国, 姜 昆, 闫培生

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209



产脂肪酶深海细菌的筛选鉴定及酶学性质研究

王 凯, 刘洪国, 姜 昆, 闫培生*

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209

从分离自南大西洋深海沉积物的细菌中筛选出一株产脂肪酶菌株FE10，通过16S rRNA序列分析，对FE10进行分子鉴定和系统发育分析，初步确定其为海杆菌属(Marinobacter)。对菌株FE10所产脂肪酶进行酶学性质初步研究表明：在实验温度条件下所产脂肪酶40℃、pH 7时酶活最高，pH 9时酶活几乎消失。

深海；微生物；脂肪酶；16S rRNA；酶学性质

脂肪酶(lipase)，全称三酰基甘油水解酶，隶属于羧基酯水解酶类，能够将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，广泛存在于动物、植物和微生物中[1]。但除猪胰脂肪酶外，动物体内的脂肪酶含量较少且活性很低；植物脂肪酶普遍存在，但主要存在于种子中，导致使用受限制[2]；微生物脂肪酶的种类多、来源广，具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度作用范围和底物的专一性类型，以及较高的催化活性和稳定性，是重要的工业酶[3]，在饲料工业、医药、洗涤工业、生物柴油、化学合成、皮革生产和造纸等领域都有应用[4]。

海洋储存着丰富的微生物资源，无论从数量还是多样性方面都是巨大的。目前研究和鉴定的海洋微生物还不到5%，海洋微生物作为产酶资源正在成为一个新的研究热点。从海洋中可以获取到脂肪酶产生菌[5]，而海洋中的低温微生物在长期适应环境的过程中，形成了独特的结构特征和生理生化特性[6]。低温脂肪酶比中温酶的催化温度低0～30℃，在较低温度下(低于40℃)有较好的催化效果，升高较少温度就可以使酶失活、终止反应，能有效降低经济成本，有很好的研究应用前景[7]。

本文从南大西洋深海沉积物中筛选到一株产脂肪酶的菌株FE10，通过16S rRNA序列测定和比对分析对该菌株的种属及酶学性质进行了初步研究。实验结果丰富了深海微生物的脂肪酶资源，并期望为其应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 培养基与溶液配方

2216E培养基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏 1 g/L，柠檬酸铁 0.1 g/L，氯化钠 19.45 g/L，氯化镁5.9 g/L，硫酸镁 3.24 g/L，氯化钙 1.8 g/L，氯化钾 0.55 g/L，碳酸氢钠 0.16 g/L，溴化钾 0.08 g/L，氯化锶 34 mg/L，硼酸 22 mg/L，硅酸钠 4 mg/L，氟化钠 2.4 mg/L，硝酸铵 1.6 mg/L，磷酸二钠 8 mg/L，琼脂 15 g/L，pH 自然，121℃灭菌 20 min。

筛选培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，葡萄糖3 g/L，橄榄油乳化剂40 g/L，罗丹明B 0.5 g/L，琼脂15 g/L，过滤沉海水1 L，pH 7.5～8。

发酵培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，葡萄糖3 g/L，橄榄油乳化剂40 g/L，过滤沉海水1 L，pH 7.5～8.0。

2%聚乙烯醇溶液：称取聚乙烯醇(PVA)2 g 溶于80 mL 水中，加热搅拌，直至全部溶解，定容至100 mL。

橄榄油乳化剂：2%聚乙烯醇∶橄榄油=3∶1混匀后，在10 000 r/min 乳化3 min后，静止5 min，再乳化3 min，制成乳白色的乳化剂。

0.05 mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液：按GB/T 601-2002配制，使用时准确稀释10倍。

磷酸缓冲液(pH 7.5)：称取磷酸二氢钾1.96 g和十二水合磷酸氢二钠39.62 g，溶于水并定容至500 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离 沉积物样品为“大洋一号”船DY26 航次 2012年7～8月期间于南大西洋站位采集。将充分混匀后的沉积物样品悬液100 μL按照10-3～10-6浓度梯度，采用稀释涂布平板法于2216E 培养基涂布分离，28℃培养箱中培养观察，及时挑取菌落培养。

1.2.2 产脂肪酶菌株的筛选 将分离获得的深海微生物采用油脂平板筛选，28℃培养箱中培养观察。以罗丹明B作为指示剂。由于脂肪酶可降解平板中的油脂，产生的脂肪酸与罗丹明B的阳离子发生作用，在350 nm紫外灯照射下出现橙黄色的荧光物质。根据菌落周围产生的荧光圈筛选产脂肪酶菌株。

1.2.3 酶活的测定 菌株于试管中培养12 h后按2%的接种量接种至锥形瓶中，于28℃、180 r/min的条件下摇瓶培养48 h。8 000 r/min、4℃条件下离心20 min后获得上清液，采用氢氧化钠指示剂滴定法测定酶活。在反应温度为35℃，反应时间为30 min的条件下，每分钟水解脂肪产生1 μmoL脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪酶活单位(U)。

1.2.4 菌株的分子鉴定 采用16S rDNA序列分析等手段对筛选获得的脂肪酶产生菌株进行分类鉴定。将分离纯化获得的菌株使用DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。16S rDNA PCR扩增的引物序列为：16SF ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16SR：5′-ACGGCTACCTTGTTACGA-CT-3′。PCR扩增程序为:94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

测序后利用EzBiocloud数据库中的EZTaxon方法与模式菌株进行比较，并利用GenBank数据库Blast功能进行同源性分析的辅助比对。比对后下载相似模式菌株的16S rDNA基因序列，采用Mega 5软件(clustalw multiple alignment)进行多序列比对和系统发育分析(neighbor-joining method)，构建系统发育树确定其分类地位。

1.2.5 脂肪酶部分酶学性质的测定 测定30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下的酶活，考察温度对脂肪酶活的影响；保持反应温度为40℃不变，测定 pH为5、6、7、8、9(精确到0.01)条件下的酶活，考察pH对脂肪酶活的影响。

2 结果与分析

2.1 产脂肪酶菌株的筛选结果

从南大西洋采集的深海沉积物中共分离纯化获得深海细菌235株。将分离获得的深海微生物采用油脂平板筛选其产脂肪酶能力，罗丹明B可与酶解产生的脂肪酸发生作用，350 nm紫外灯照射下在菌落周围产生橙黄色的荧光物质。其中FE10菌株48 h后即可观察到完整的荧光圈，采用氢氧化钠指示剂滴定法测定脂肪酶活达到2 U/mL将其用于后续研究。

2.2 FE10的分子鉴定

将FE10菌株的16S rDNA序列与EZTaxon上的已知模式菌株序列进行同源比对，发现FE10的序列与模式菌株Marinobacterhydrocarbonoclas-ticusATCC 49840T(FO203363) 的序列相似，同源性达到98.30%。GenBank数据库Blast功能进行辅助比对，结果显示同源性最高的菌株亦为海杆菌属(Marinobacter)菌株，同源性达到98%。采用Mega5软件的邻接法(neighbor-joining method)进行系统发育分析，构建系统发育树如图1所示。从构建的系统发育树可以看出FE10菌株与海杆菌属的菌株最为接近。初步确定FE10菌株属于交替单胞菌目(Alteromonadales)，交替单胞菌科(Alteromonadaceae)，海杆菌属(Marinobacter)。目前发现的海杆菌多为低温菌，其中有些菌种对芳烃和烷烃的降解有较好的效果[8～10]，期望其可应用于石油烃的降解。

图1 基于16S rDNA序列邻接法构建的FE10菌株和相关模式菌株的系统发育树Fig.1 Neighbor-joining tree based on the 16S rRNA sequences of strain FE10 and other related representative strains.

2.3 部分酶学特性研究

2.3.1 脂肪酶的催化活性随温度的变化结果 在30～70℃温度范围内测定脂肪酶的催化活性随温度的变化情况，结果如图2所示。

图2 温度对酶活的影响Fig.2 The effect of temperature on lipase activity.

结果表明，菌株FE10所产脂肪酶在现有实验温度条件下40℃时酶活最高，在60℃仍有40%的酶活。菌株FE10所产脂肪酶最适温度应为40℃左右，符合低温酶的定义，对于酶反应的最适温度，还有待进一步研究。

2.3.2 脂肪酶的催化活性随pH的变化结果 在5～9的pH范围内测定脂肪酶的催化活性随pH的变化情况，结果如图3所示。

图3 pH对酶活的影响Fig.3 The effect of pH on lipase activity.

结果表明，菌株FE10所产脂肪酶在pH 7时酶活最高，随着酸性或碱性的增强酶活降低。pH 9时酶活几乎为零，可能是碱性环境对酶分子结构产生了破坏，影响了酶分子的结合能力，从而降低了催化活性。

3 讨论

海洋的高盐、高压、寡营养和无光照等特殊生态环境决定了海洋微生物种类的多样性和特殊性，因而造成了具有独特的代谢途径和遗传背景并且能够产生具有独特结构和功能的酶类物质。脂肪酶在陆地分离的报道较多，如顾美英等[11]从新疆低温环境土样中筛选到的茁芽丝苞酵母菌GL-1所产低温脂肪酶在30℃时活性最强，45℃以上迅速失活；张海荣等[12]研究的Fusariumsp.菌株的低温脂肪酶25℃时活性最高，60℃时活性基本消失。有研究表明不同来源的脂肪酶最适pH不同，如陈贵元[13]从昆明一屠宰场冷库样品得到的Serratiasp.KM1所产低温脂肪酶的最适pH为9.0；周晶[14]研究的AspergillusoryzaeCJLU-31所产的低温脂肪酶的最适pH为4.0，pH为6时严重失活；李珍等[15]从富含油脂的土壤中筛选到的Penicilliumchrysogenum-J23所产低温脂肪酶的最适pH则是7.5，接近中性，与菌株FE10所产脂肪酶的最适pH一致。但国内外关于海洋来源脂肪酶的报道还不是很多[16～18]，而且其中部分研究是针对不可培养微生物的脂肪酶基因开展的研究[19,20]，不利于菌种产酶的实际应用。这些研究结果丰富了深海微生物的脂肪酶资源，为其后续在环境、食品、医药等领域的应用提供了理论参考。

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日本在最深海沟发现罕见细菌

海床的平均深度是4 000米，而位于西太平洋的马里亚纳海沟的挑战者深渊谷底深度接近11 km。日本研究人员借助一台远程操控机器人，发现了一个细菌群落正在茁壮成长，这种被称为“异养微生物”的细菌并不能自己产生食物，必须“猎食”水中的其他微生物细菌才能得以生存。

论文链接:Nunoura T,Takaki Y,Hirai M,etal..Hadal biosphere: Insight into the microbial ecosystem in the deepest ocean on Earth.

Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America,2015,112(11): E1230-E1236.Doi: 10.1073/pnas.1421816112

Abstract: Hadal oceans at water depths below 6,000 m are the least-explored aquatic biosphere.The Challenger Deep,located in the western equatorial Pacific,with a water depth of ～11 km,is the deepest ocean on Earth.Microbial communities associated with waters from the sea surface to the trench bottom (0～10 257 m) in the Challenger Deep were analyzed,and unprecedented trench microbial communities were identified in the hadal waters (6 000～10 257 m) that were distinct from the abyssal microbial communities.The potentially chemolithotrophic populations were less abundant in the hadal water than those in the upper abyssal waters.The emerging members of chemolithotrophic nitrifiers in the hadal water that likely adapt to the higher flux of electron donors were also different from those in the abyssal waters that adapt to the lower flux of electron donors.Species-level niche separation in most of the dominant taxa was also found between the hadal and abyssal microbial communities.Considering the geomorphology and the isolated hydrotopographical nature of the Mariana Trench,we hypothesized that the distinct hadal microbial ecosystem was driven by the endogenous recycling of organic matter in the hadal waters associated with the trench geomorphology.

单病毒粒子示踪技术揭示海水鱼类病毒侵染机制

中国科学家首次将单病毒粒子示踪技术应用于水生经济动物大分子DNA病毒研究，从时间、空间尺度多层次揭示了石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)侵染宿主活细胞的机制，研究结果有助于深入理解SGIV的致病机理和提供理想的病毒-细胞模型。

论文链接:Wang S W,Huang X H,Huang Y H,etal..Entry of a novel marine DNA virus,singapore grouper iridovirus,into host cells occurs via clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis in a pH-dependent manner.

Journal of Virology,2014,88(22): 13047-13063.Doi: 10.1128/JVI.01744-14.

Abstract: Iridoviruses are nucleocytoplasmic DNA viruses which cause great economic losses in the aquaculture industry but also show significant threat to global biodiversity.However,a lack of host cells has resulted in poor progress in clarifying iridovirus behavior.We investigated the crucial events during virus entry using a combination of single-virus tracking and biochemical assays,based on the established virus-cell infection model for Singapore grouper iridovirus (SGIV).SGIV infection in host cells was strongly inhibited when cells were pretreated with drugs blocking clathrin-mediated endocytosis,including sucrose and chlorpromazine.Inhibition of key regulators of macropinocytosis,including Na+/H+exchanger,Rac1 GTPase,p21-activated kinase 1 (PAK1),protein kinase C (PKC),and myosin II,significantly reduced SGIV uptake.Cy5-labeled SGIV particles were observed to colocalize with clathrin and macropinosomes.In contrast,disruption of cellular cholesterol by methyl-β-cyclodextrin and nystatin had no effect on virus infection,suggesting that SGIV entered grouper cells via the clathrin-mediated endocytic pathway and macropinocytosis but not via caveola-dependent endocytosis.Furthermore,inhibitors of endosome acidification such as chloroquine and bafilomycin A1 blocked virus infection,indicating that SGIV entered cells in a pH-dependent manner.In addition,SGIV particles were observed to be transported along both microtubules and actin filaments,and intracellular SGIV motility was remarkably impaired by depolymerization of microtubules or actin filaments.The results of this study for the first time demonstrate that not only the clathrin-dependent pathway but also macropinocytosis are involved in fish DNA enveloped virus entry,thus providing a convenient tactic for exploring the life cycle of DNA viruses.

海洋生物多糖材料研究中取得进展

以海藻酸钠为代表的海洋生物多糖材料来源广泛、生物安全性高、可降解，并且具有抗病毒、增强机体免疫力等多种生物活性，在生物医用材料及药物传递系统领域有广泛的应用研究。科研人员在对海洋多糖材料深入研究的基础上，首次发现了海藻酸钠形成的聚合物具有抑制胰蛋白酶酶解这一新的生物学特性。该聚合物通过缠绕包裹作用束缚蛋白酶，阻止其与底物的接触，从而实现抑制酶解作用。该工作以活性蛋白药物胰岛素为模型，以海藻酸钠为蛋白酶抑制剂，体外酶解实验表明该抑制剂可有效阻止胰蛋白酶对口服药物的酶解，其抑酶效率约为现有同类商品的400倍，是理想的蛋白及多肽类活性药物的功能性载体，为解决蛋白与多肽类药物口服提供了新的策略，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

论文链接:Lv Y,Zhang J B,Song Y Z.Natural anionic polymer acts as highly efficient trypsin inhibitor based on an electrostatic interaction mechanism.

Macromolecular Rapid Communications,2014,18,1606-1610.Doi: 10.1002/marc.201400267.

Abstract: Sodium alginate (SA),acting as a trypsin inhibitor by means of electrostatic interaction,is studied.The half-maximal inhibitory concentration (IC50=0.05 μg mL-1) of this natural anionic polymer is about 400 times lower than that of commercial soybean trypsin inhibitor (STI).Unlike the Ca2+-deprivation mechanisms,its inhibition may be attributed to preventing the trypsin active site (TAS) from accessing the macromolecular substrates instead of denaturing it.SA is an efficient,innocuous,and cost-effective inhibitory excipient that can be conveniently used in many peptide and protein dosage formulations.

Study on Classification and Enzymatic Propertis of Deep-sea Bacteria Producing Lipase

WANG Kai,LIU Hong-guo,JIANG Kun,YAN Pei-sheng*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

The bacterial strain FE10 producing lipase was screened from deep sea bacteria,which isolated from deep-sea sediment of South Atlantic.The molecular identification of 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis showed that FE10 belonged to the genusMarinobacter.The results of preliminary study on the lipase characterization showed that optimal temperature of the lipase activity was 40℃ under laboratory conditions.The lipase activity was high at pH 7,and almost disappeared at pH 9.

deep sea; microbes; lipase; 16S rRNA; enzymatic characteristics

2015-04-01; 接受日期：2015-04-24

中国大洋协会国际海域资源调查与开发“十二五”重大项目(DY125-15-R-01)；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2014NY012)；哈尔滨工业大学学科建设引导基金(WH20140202)资助。

王凯，讲师，博士,研究方向为环境微生物防治有害真菌的方法及机理、海洋功能细菌的多样性及应用。E-mail：ywkhit@hotmail.com。*通信作者：闫培生，教授，博士生导师，研究方向为海洋微生物资源与利用、海洋生物质及其加工废物的高值资源化、有害微生物的生物防治与生物农药、微生物发酵工程与生物制药等。E-mail：yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.16