麻花秦艽水浸提液对紫花苜蓿和小麦种子萌发和幼苗生长的影响

许可成，魏小红，赵 萌，刘文瑜

(甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070)

麻花秦艽(Gentiana stramine)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)多年生草本植物，是我国重要的藏药材资源之一，主要有清热利胆、舒筋止痛、祛风湿之功效［1］。长期以来，受制于有限的耕地、种植条件等因素，在麻花秦艽栽培种植过程中存在着严重的“连作障碍”，植株常出现生长发育不良，品质和产量大幅度下降，病虫害加剧［2-3］，在天然草地上通常可见麻花秦艽成单一群落生长现象，这些现象可能与其化感作用有关。

化感作用一般指的是某种植物的地上或者地下部分通过向其生长环境中释放一些化学活性物质(即化感物质)，进而直接或间接影响到周围其他植物(受体植物)的生长和发育，可在种间或种内进行［4-7］。植物生长过程中产生的次生代谢产物是其化感物质的主要来源［8-10］。具有药用价值的植物其体内基本都含有特殊的药用化学物质，这些化学物质比较容易释放到周围环境中［11-13］。所以，药用植物更易产生化感物质，一般具有较强的化感作用，但麻花秦艽化感作用一直缺乏研究。因此，本研究采用室内生物测定方法，以代表性豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa)和禾本科小麦(Triticum aestivum)为受体植物，通过分析麻花秦艽叶和根的水浸提液对两种受体植物种子萌发、幼苗生长的影响，探讨麻花秦艽化感作用强弱和受体植物与麻花秦艽轮作缓解其连作障碍的可能性，为深入研究和利用麻花秦艽次生代谢产物以及寻找适宜的轮作植物建立合理的栽培制度提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 自然概况与样品采集

该试验所用麻花秦艽采集于青藏高原边缘的东祁连山金强河地区，采集地位于102°29' －102°23'E，37°11' －37°13' N。该地区海拔2 970 m，气候寒冷潮湿，空气稀薄，太阳辐射强，年均温0.1 ℃;野生植物有120 d 左右的生长期;年日照时数2 600 h，年降水量416 mm 。

供试植物麻花秦艽于2012 年9 月，采集于多年围栏封育草地，为生长3 年以上处于果实成熟期的野生麻花秦艽。挖取整株植株带回实验室，把根与叶分离，洗净，自然风干后粉碎，过0.42 mm 筛后贮藏。

受体植物:紫花苜蓿(阿尔冈金号)为多年生豆科牧草，抗逆性强、适应性广，为优良牧草;春小麦(陇春30 号)为一年生禾本科粮食作物，适应性较广。两者在麻花秦艽栽培地均有种植，其种子购于甘肃省农业科学院。

1.2 试验方法

1.2.1 麻花秦艽不同部位浸提液的制备 参照李俊和刘增文［14］的方法，有改动。将自然风干的麻花秦艽根、叶分别称取100 g，加入500 mL 灭菌蒸馏水，在室温下(20 ～24 ℃)浸泡48 h(期间每隔12 h摇动5 min)，将浸提液先用定量滤纸过滤，再用滤元单位为0.45 μm 的微孔滤膜过滤，用灭菌蒸馏水对过滤所得浸提液定容，再经3 次消毒处理后得到不含微生物(浓度为0.2 g·mL－1)的麻花秦艽浸提液母液，于4 ℃冰箱贮存备用，用时按体积比稀释至0.1、0.05 和0.025 g·mL－1。

1.2.2 种子萌发试验 采用培养皿滤纸法［15］，挑选紫花苜蓿和小麦种子，用0.1% HgCl2溶液对受体植物种子消毒3 ～5 min，无菌蒸馏水对消毒后的种子反复多次冲洗后均匀置于培养皿中(预先垫有双层滤纸，滤纸和培养皿提前做无菌处理)，每皿50粒，每个培养皿分别加入不同浓度麻花秦艽叶和根的浸提液15 mL，对照加入15 mL 无菌蒸馏水，每个处理组3 次重复。将所有培养皿用保鲜膜包好，防止水分散失和交叉污染，然后置于(25 ±1)℃恒温光照培养箱内，在12 h 光照/12 h 黑暗的条件下进行培养，整个培养过程中确保加湿器正常工作。每天统计种子发芽数，统计试验结束的标记是以持续3 d 不再有新受体植物种子发芽，计算种子最终发芽率、发芽势(4 d)和发芽指数［14］。

1.2.3 幼苗生长和保护酶系统有关指标测定 受体植物幼苗培养:参照张志忠等［16］的方法，对受体植物种子进行消毒处理，常温催芽后均匀置于培养皿中(每皿50 粒)，再加入各浓度浸提液5 mL，之后每3 d 加1 次浸提液，以保证其浓度。用无菌蒸馏水处理作对照，进行培养。培养条件为温度(25 ±1)℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照4 000 lx。每隔24 h 观察幼苗生长状况，7 d 后取样，用于幼苗苗高、根长和鲜重的测定。幼苗苗高和根长用直尺测量，植株鲜重用电子分析天平直接称重。继续将幼苗培养3 d 后，进行各项生理指标测定。

参照陈建勋和王晓峰［17］的方法，分别测定受体植物幼苗中过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.2.4 数据统计分析 各项试验均重复3 次，所得数据用Excel 2007 软件求得平均值和标准差，采用SPSS 软件对不同处理进行单因素方差分析，采用Duncan 检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 麻花秦艽水浸提液对紫花苜蓿和小麦种子萌发的影响

不同浓度麻花秦艽叶的水浸提液处理都抑制了紫花苜蓿种子萌发，并且这种抑制作用与浸提液浓度呈正比。根的水浸提液处理下，除低浓度(0.025 g·mL－1)对紫花苜蓿发芽率和发芽势有一定的促进作用外，其余也均为抑制，且与对照差异显著(P ＜0.05)。麻花秦艽叶和根的水浸提液处理下，小麦种子萌发均受到不同程度的抑制。总体来看，相同浓度下叶的水浸提液较根的水浸提液对紫花苜蓿种子萌发的抑制作用强;相比小麦种子萌发，叶和根的水浸提液对紫花苜蓿种子萌发的抑制作用较强(表1)。

2.2 麻花秦艽水浸提液对紫花苜蓿和小麦幼苗生长的影响

不同浓度麻花秦艽叶和根的水浸提液对紫花苜蓿和小麦幼苗生长的影响表现出很大的差异(图1)。其中叶的水浸提液对两种受体植物幼苗生长的3 个指标都表现一定的抑制作用，较高浓度(0.05和0.1 g·mL )处理与对照相比大多差异显著(P＜0.05)。而根的水浸提液处理下，0.025 g·mL－1时对紫花苜蓿幼苗生长则表现促进作用，但与对照相比差异不显著(P ＞0.05)，而其他浓度处理下均为抑制作用。麻花秦艽叶和根的水浸提液对受体植物幼苗生长的影响与对种子萌发的影响基本一致。

图1 不同浓度麻花秦艽浸提液处理下的紫花苜蓿和小麦幼苗生长相关指标Fig.1 Growth of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from Gentiana stramine

2.3 麻花秦艽水浸提液对紫花苜蓿和小麦幼苗抗氧化酶活性的影响

麻花秦艽水浸提液对受体植物幼苗叶片中3 种抗氧化酶活性的影响不同(图2)。其中，与对照相比，随着麻花秦艽叶和根的水浸提液浓度的增大，SOD 和POD 活性变化总体上呈现升高的趋势。但0.025 g·mL－1叶的水浸提液处理下，紫花苜蓿叶片SOD 活性变化最大，说明此浓度下诱导使其活性快速增强，清除自由基的危害。而其他浸提液浓度处理下SOD 和POD 活性都是在0.1 g·mL－1时达到最大值。

CAT 活性变化比较复杂，随着叶的水浸提液浓度的升高，紫花苜蓿叶片CAT 活性呈现先增大后减小再增大的趋势;而小麦先增大，但最高浓度0.1 g·mL－1时却比对照显著降低(P ＜0.05)。随着根的水浸提液浓度的升高，紫花苜蓿叶片CAT活性持续升高;而小麦叶片CAT 活性总体也升高，在最高浓 度0. 1 g·mL－1时 反 而 比 中 间 浓 度0. 05 g·mL－1低。

图2 不同浓度麻花秦艽浸提液处理下的紫花苜蓿和小麦幼苗的抗氧化酶活性Fig.2 The antioxidant enzyme activity of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from Gentiana stramine

2.4 麻花秦艽水浸提液对紫花苜蓿和小麦幼苗丙二醛(MDA)含量的影响

随着浸提液浓度的增加，MDA 含量均持续升高(图3)。0.1 g·mL 根的水浸提液处理使紫花苜蓿和小麦MDA 含量分别比对照增加了90. 31%、23.14%。而叶的水浸提液处理下，当浸提液浓度达到0.1 g·mL－1时，与对照相比，紫花苜蓿和小麦MDA 含量分别增加了137%、73%，呈显著性差异(P ＜0.05)。

图3 不同浓度麻花秦艽浸提液处理下紫花苜蓿和小麦幼苗的MDA 含量变化Fig.3 The MDA content of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from G. straminea

3 讨论

种子萌发在植物生活史中起着基础性作用，同时植物种子萌发和幼苗生长初期更易受到外界环境变化的影响，因此，种子萌发和幼苗生长状况常作为植物的抗逆性评价标志。一般而言，外界胁迫效应越强，对受体植物所产生的抑制作用就越强，但不同受体植物对这种外界胁迫通常会表现出差异性［18-19］。在本研究中，两种受体植物对同一浓度麻花秦艽浸提液胁迫的反应并不一致。相比较而言，禾本科小麦所受到的抑制作用较豆科紫花苜蓿弱的多，可能是麻花秦艽浸提液中所含的化感活性物质对紫花苜蓿的胁迫效应更强，也可能与两者种子结构不同有关。麻花秦艽对小麦的抑制作用较弱，可以用于麻花秦艽轮作体系，缓解其连作障碍，这可能也是农业生产中将小麦用于麻花秦艽倒茬的原因所在。

植物体内的SOD、POD、CAT 等抗氧化酶可以抵御和清除活性氧，抑制膜质过氧化，通常在维持植物细胞中的活性自由基处于较低水平有特殊作用。一般外界环境胁迫会使植物的抗氧化酶系统受到影响，在极短的时间内诱导活性氧的爆发，降低植物清除自由基的能力，使其抗性减弱，从而导致植物细胞损伤，生长受到抑制，植物体内抗氧化酶活性也会在胁迫下发生相应的变化［20-23］。MDA 是植物膜质过氧化的重要代谢产物，膜质过氧化损伤程度可以用MDA 含量进行衡量。同时，MDA 本身被认为是有毒物质，其能与植物细胞内某些化学成分发生了强烈的互相作用，造成植物膜系统受损，膜功能被破坏［24］。本研究中，低浓度0.025 g·mL－1叶的水浸提液处理时，紫花苜蓿体内SOD、CAT 活性变化较大，可能是紫花苜蓿对浸提液的胁迫比较敏感，可以迅速诱导体内酶活性升高。而其他浓度浸提液处理下，紫花苜蓿和小麦幼苗SOD、POD、CAT 活性的总体变化趋势也都是升高，说明在麻花秦艽浸提液胁迫下，受体植物幼苗产生生理响应，启动了抗氧化酶体系，使幼苗体内抗氧化能力增强，加速了体内自由基清除速率，阻止膜质过氧化。但与此同时对植物细胞有害物质MDA 的含量上升，使受体植物正常的生长代谢活动受到影响。

近年来，药用植物自毒作用及对其他植物生长的化感作用引起了越来越多学者的关注，已对多种药用植物的化感作用进行了研究［10，25-28］。在自然生态环境中，当土壤中的化感物质累积到一定量后，就会通过延长种子发芽时间、降低发芽速率和抑制幼苗生长等影响植物生长［1］。本研究证实，麻花秦艽叶和根的水浸提液对两种受体植物种子萌发和幼苗生长都有一定程度的抑制，并且随着浸提液浓度的增加，这种抑制作用逐步增强。在麻花秦艽栽培过程中，可能将化感物质释放进土壤，不仅对自身的连作产生影响，对后茬作物生长也有一定程度的危害。对麻花秦艽的化学成分分析表明，其体内主要含有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷等环烯醚萜苷类化合物，还含有苦参酮、苦参酚等黄酮类化合物以及有机酸等［29-31］。而黄酮类物质和有机酸现已被证实有很多为化感物质［25］，麻花秦艽对受体植物的抑制作用是否由这些活性物质导致，还有待进一步研究证实。同时由于本研究所用浸提液浓度相对较大，除了化感作用外，是否由渗透势引起也有待后续继续研究。

本研究仅在实验室条件下分析了中草药麻花秦艽叶和根的水浸提液的化感作用，结果表明麻花秦艽水浸提液对受体植物紫花苜蓿和小麦种子萌发和幼苗生长表现出不同的抑制作用，受体植物细胞内抗氧化酶活性的不同变化可能是其抑制作用的重要生理机制。这种抑制作用可能是由于麻花秦艽中所含化感物质引起，但由于化感物质作用的复杂性以及浸提液渗透势的干扰，同时室内试验避免了外界自然条件多种因素的干扰，因此麻花秦艽化感作用特点和自然条件下麻花秦艽对其他植物的化感作用是否和本研究所得结果一致，还需要进一步研究。如果证实麻花秦艽存在明显化感作用，就可以利用麻花秦艽化感物质对不同植物作用效果不同的特点，建立作物和麻花秦艽的间、套及轮作制度，缓解或克服麻花秦艽连作障碍，为麻花秦艽合理栽培制度的建立和更好地利用这一药用植物资源提供理论依据。

［1］ 陈垣，邱黛玉，郭凤霞，王恩军，柳福智.麻花秦艽开发利用探讨［J］.中药材，2007，30(10):1214-1216.

［2］ 马玉花，孙峰，孙菁，陈桂琛，徐文华.藏药麻花秦艽的研究进展［J］.安徽农业科学，2005，33(9):1698-1699.

［3］ 郭兰萍，黄璐琦，蒋有绪，吕冬梅.药用植物栽培种植中的土壤环境恶化及防治策略［J］.中国中药杂志，2006，31(9):714-717.

［4］ 孔垂华，胡飞.植物化感(相生相克)作用及其应用［M］.北京:中国农业出版社，2001:2.

［5］ Meiners S J，Kong C H，Ladwig L M，Pisula N L，Lang K A.Developing an ecological context for allelopathy［J］.Plant Ecology，2012，213:1221-1227.

［6］ Suikkanen S，Fistarol G O，Graneli E. Allelopathic effects of the Baltic cyanobacteria，Nodularia spumdigena，Aphanizomenon flosaquae and Anabaena lemmermannii on algal monocultures［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2004，308(1):85-101.

［7］ Hewitt R E，Menges E S. Allelopathic effects of Ceratiola ericoides (Empetraceae)on germination and survival of six Florida scrub species［J］.Plant Ecology，2008，198(1):47-59.

［8］ 徐蕊，刘权，燕志强，金辉，崔海燕，蒲训，秦波.红车轴草对莴苣生长抑制作用研究［J］.草业学报，2011，20(6):45-51.

［9］ 孔垂华，徐涛，胡飞，黄寿山.环境胁迫下植物的化感作用及其诱导机制［J］.生态学报，2000，20(5):849-854.

［10］ 王树起，韩晓增，乔云发.根系分泌物的化感作用及其对土壤微生物的影响［J］.土壤通报，2007，38(6):1219-1226.

［11］ 周洁，郭兰萍，黄璐琦，曾燕，张永清.植物化感作用及其在中药材栽培中的应用［J］.世界科学技术——中医药现代化，2007，9(5):34-38.

［12］ 张重义，林文雄.药用植物的化感自毒作用与连作障碍［J］.中国生态农业学报，2009，17(1):189-196.

［13］ 郭兰萍，黄璐琦，蒋有绪，陈保冬，朱永官，曾燕，付桂芳，付梅红.苍术根茎及根际土水提物生物活性研究及化感物质的鉴定［J］.生态学报，2006，26(2):528-535.

［14］ 李俊，刘增文.4 种针叶纯林枯落叶对3 种豆科灌草的化感效应［J］.草业科学，2013，30(7):1057-1065.

［15］ 曾任森.化感作用研究中的生物测定方法综述［J］.应用生态学报，1999，10(10):123-126.

［16］ 张志忠，石秋香，孙志浩，蓝茂锋.入侵植物空心莲子草对生菜和萝卜的化感效应［J］.草业学报，2013，22(1):288-293.

［17］ 陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导［M］.广州:华南理工大学出版社，2006:68-74.

［18］ Ding J，Sun Y，Xiao C L，Xiao C L，Shi K，Zhou Y H，Yu J Q.Physiological basis of different allelopathic reactions of cucumber and figleaf gourd plants to cinnamic acid［J］.Journal of Experimental Botany，2007，58(13):3765-3773.

［19］ 黄高宝，柴强，黄鹏.植物化感作用影响因素的再认识［J］.草业学报，2005，14(2):16-22.

［20］ Weir T L，Park S W，Vivanco J M.Biochemical and physiological mechanisms mediated by allelochemicals［J］.Current Opinion in Plant Biology，2004，7(4):472-479.

［21］ 朱慧，马瑞君，陈树思，王明理.高寒草场主要牧草对黄帚橐吾水浸液化感胁迫的生理响应［J］.草业学报，2007，16(5):102-106.

［22］ Yu J Q，Ye S F，Zhang M F，Hu W H.Effects of root exudates and aqueous root extracts of cucumber (Cucumis sativus)and allelochemicals，on photosynthesis and antioxidant enzymes in cucumber［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2003，31(2):129-139.

［23］ Basis H P，Vepachedu R，Gilroy S，Callaway R M，Vivanco J M. Allelopathy and exotic plant invasion:From molecules and genes to species interactions［J］.Science，2003，301:1377-1380.

［24］ Lin C C，Kao C H.Effect of NaCl stress on H2O2metabolism in rice leaves［J］.Plant Growth Regulation，2000，30:151-155.

［25］ 王田涛，王琦，王惠珍，张恩和.当归自毒作用和其对不同作物的化感效应［J］.草地学报，2012，20(6):1132-1138.

［26］ 王明道，陈红歌，刘新育，高玉千，吴坤，贾新成.地黄对芝麻的化感作用及其化感物质的分离鉴定［J］.植物生态学报，2009，33(6):1191-1198.

［27］ 银福军，瞿显友，曾纬，舒抒.黄连不同部位水浸液自毒作用研究［J］.中药材，2009，32(3):329-330.

［28］ 高兴祥，李美，高宗军，张宏军，张佳.苍耳对不同植物幼苗的化感作用研究［J］.草业学报，2009，18(2):95-101.

［29］ 武云霞，陈光，喻长远.麻花秦艽化学成分的研究［J］.北京化工大学学报，2008，35(2):64-67.

［30］ 纪兰菊，马玉花，陈桂琛，周国英，代冬海，孙洪发.藏药麻花秦艽中苦苷类成分的含量测定及品质评价［J］.西北植物学报，2004，24(2):292-295.

［31］ 贾娜，张雅惠，王斌，尚平平，孙文基.麻花秦艽中落干酸和龙胆苦苷的含量测定及麻花秦艽药材HPLC 特征图谱的研究［J］.药物分析杂志，2009，29(9):1585-1589.