冷藏酱鸭中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究

陈娟娟等

摘要： 从冷藏的酱鸭中分离筛选乳酸菌，对其进行生理生化特性研究和分子学鉴定。结果表明，从冷藏酱鸭中筛选到2株优良乳酸菌，分别命名为J1、J2。结合细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性以及系统进化树分析表明J1、J2为副干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp.），具有比较好的发酵产酸的能力，并且对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）具有很强的抑制作用，能够耐受极端的pH环境。

关键字：酱鸭；乳酸菌；分离；鉴定

中图分类号：Q939.11+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0676-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.044

Identification and Biological Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolation

from the Sauce Duck in Low Temperature

CHEN Juan-juan1，ZHOU Yan-qing1，LI Jing-yun1，ZHANG Yu1，WANG Wan-shen1，FAN Yu-xia1，

CHANG Zhao1，YUE Xiao-jie1，YUAN Lu-lu2

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2. Zhoukou Science and Technology Bureau，Zhoukou 466000，Henan， China）

Abstract： The research aimed to isolate and screen the fine lactic acid bacteria from the sauce duck in low temperature and identify them by molecule and biochemical test. Two strains of lactic acid bacteria were isolated and named J1 and J2. With the analysis of bacterial morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA sequence homology and phylogenetic tree analysis， it showed that J1 and J2 were Lactobacillus paracasei subsp. J1 and J2 have a good ability to produce acid fermentation and to inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and both can tolerate extreme pH environment.

Key words： sauce duck； lactic acid bacteria； isolation； identification

乳酸菌是一种常见的益生菌，具有直接为宿主提供营养物质、促进人和动物生长、调节胃肠道及泌尿生殖道的正常菌群、增强机体免疫和维持微生态平衡等多种功能[1]，被广泛应用到医学、食品、饲料工业和环保等方面。乳酸菌在自然界分布广泛，从人体及动物的肠道，到植物、发酵食物、饮料乃至土壤中都存在乳酸菌。曾经有研究者报道过从肠道内容物[2]，发酵的乳制品[3，4]，腌制的泡菜[5，6]，冷藏的鲜肉[7]，发酵的肉制品[8]中分离出各种优质乳酸菌。

肉类中，鸭是一种常见的加工原材料，可以直接或发酵后制成板鸭、卤鸭、酱鸭、虾油鸭等[9，10]，每一种做法都会赋予其特殊的风味。乳酸菌在发酵的过程中可以产生乙醛和双乙酰等风味物质，从而使发酵制品具有特殊的风味，而发酵的鸭类可能是因为乳酸菌产生了一些风味物质，使其有了独特的风味。林巧[9]从发酵的建昌板鸭中分离到了17株菌株，通过形态学和生理生化特征进行了鉴定，并从中筛选出了一株耐盐的适合发酵板鸭的菌株。本研究旨在从冷藏的酱鸭中分离乳酸菌，通过形态学、生理生化特征和基因学进行鉴定，再通过发酵产酸试验、低pH耐受试验、抑菌试验等进一步研究其特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集 从河南省新乡市温州酱鸭店购买一只酱鸭，放于无菌的袋子里并放进冰盒内，带回实验室于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.1.2 培养基 MRS培养基，明胶液化培养基，葡萄糖产酸培养基，葡萄糖酸盐产酸培养基，脱脂奶粉培养基，按文献[11]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离及筛选 将放在4 ℃冰箱2周的酱鸭取出，用无菌解剖剪取1 g，并且充分剪碎，加入9 mL无菌生理盐水中，充分摇匀，然后依次稀释到10-4、10-5、10-6，分别吸取100 μL接种在含1.5%的CaCO3的MRS平板培养基上，37 ℃恒温培养箱内培养48 h。挑取具有透明圈的单菌落划线纯化，连续纯化3次，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鉴定 参照文献[11]，通过革兰氏染色、接触酶反应、运动性试验、明胶液化试验、葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气试验、甘油发酵试验、D-山梨醇发酵试验、淀粉发酵试验、蔗糖发酵试验等对分离到的乳酸菌进行初步的鉴定[11]。

1.2.3 乳酸菌的分子鉴定 将活化好的菌株利用CTAB的方法提取菌株的总DNA，以基因组DNA为模版扩增16S rRNA。引物是用Chao等[12]报道过的引物，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1541R： AAGGAGGTGATCCAGCCGCA扩增其16S rRNA，引物由华大生物有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，其中10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL， EasyTaq 0.25 μL，模版DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，无菌去离子水16.75 μL。反应条件：94 ℃ 3 min预变性；94 ℃ 30 s ，55 ℃30 s ，72 ℃ 1 min，进行35个循环；最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收1 500 bp左右的片段，用生工生物工程（上海）有限公司的胶回收试剂盒回收，回收产物送到生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序结果在NCBI GenBank数据库中进行同源性比较，并且用MEGA5.05建系统进化树做进一步的分析。

1.2.4 乳酸菌产酸能力的测定 乳酸菌发酵产酸的能力是作为发酵酸奶的优良菌株筛选的重要指标。酸奶的酸度一般以中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L氢氧化钠的毫升数来表示，称为°T，此为滴定酸度简称为酸度。将待测菌株接种于MRS培养液，37 ℃恒温培养过夜，活化3代，以充分活化实验菌株。将活化好的菌株按3%的接种量接种于装有10%脱脂乳培养基的试管中，37 ℃恒温培养至凝乳，记录凝乳时间。凝乳后置于4 ℃冰箱中后熟24 h，测定每个管的pH和滴定酸度。每株3个重复。

pH的测定用PHS-320型酸度计测量，测酸度用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定，采用吉尔涅尔度（°T）表示，按参考文献[13]。具体步骤：量取10 mL鲜乳，注入150 mL三角烧瓶内，用20 mL中性蒸馏水稀释，加入1%酚酞指示剂5滴，小心混匀，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，不断摇动，直至微红色在1 min不消失为止。将滴定时所耗的0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的量乘以10，即为100 mL酸奶的酸度。

1.2.5 乳酸菌耐酸能力的测定[14] 将待测菌株接种于MRS培养基中培养48 h，8 000 r/min，4 ℃离心10 min。细胞沉淀用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗2次，并悬浮至细胞密度为1×1012个/mL。然后加到pH为1.0、2.0、3.0的磷酸盐缓冲液中32 ℃孵育，每1、2、3、4 h取出100 μL接种在MRS平板培养基上，同时取100 μL没有经过低pH磷酸盐缓冲液处理的菌液接种在MRS平板培养基上，34 ℃培养48 h，最后记录平板上的单菌落个数。乳酸菌的存活率的计算方法是用低pH处理过的单菌落数除以没有经过处理的单菌落数。

1.2.6 乳酸菌的抑菌能力测定[14] 将待测菌株接种在MRS液体培养基中活化3代后，取100 μL接种在MRS液体培养基中37 ℃过夜培养，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清培养液，调节pH为5.5（pH 5.5时抑菌能力最大），用来检测抑菌活性。指示菌株有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。在双层平板上用无菌打孔器打出直径为6 mm的孔，将100 μL无菌的培养液加入孔内，以不溢出为宜，于4 ℃过夜使加入的培养液充分扩散，37 ℃培养48 h。抑菌能力通过测量抑菌圈的直径来表示，单位为mm。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选结果

从冷藏酱鸭中分离得到表面光滑湿润、边缘整齐、乳白色的菌株共25株，分别命名为J1、J2、J3、J4…J24、J25。其中J1、J2的透明圈最大，透明圈越大说明其产酸能力越强，发酵能力就越强。故对J1、J2进行了鉴定及性能研究。

2.2 菌株的鉴定结果

2.2.1 菌落及菌体形态特征鉴定 J1、J2的菌落及菌体特征见表1。从表1中的菌落形态以及菌体形态可以鉴定这2株菌株为杆菌，并且可以初步鉴定为疑似乳酸菌。

2.2.2 生理生化鉴定 生理生化鉴定结果如表2，结合菌落和菌体形态，可以初步判断这2株菌株是乳酸杆菌。J1、J2均可发酵葡萄糖产酸而不产气，发酵葡萄糖酸盐产酸产气，因此可以判J1、J2为兼性异型发酵的乳酸杆菌。

2.2.3 16S rRNA PCR扩增产物和测序结果 将J1、J2用液体培养基活化3次后提取细菌基因组DNA，进行16S rRNA PCR扩增、回收、测序，获得长度分别为1 512 bp和1 516 bp的碱基序列，将这两个序列在NCBI GenBank数据库中进行同源性比对发现J1、J2与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌亚种、干酪乳杆菌亚种、玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的同源性都达到了99%。按照目前通用的分类标准：具有99%～100%序列相似性的判定为1个种，具有97%～99%序列相似性的判定为1个属，可将J1、J2判定为乳杆菌属。下载干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌亚种、玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的16S rRNA的序列，用MEGA5.05建系统进化树如图1，从图1中可知，J1、J2与副干酪乳杆菌亚种（L. paracasei subsp R094， L. paracasei subsp. NBRC 15906）在一个分支上，结合NCBI GenBank数据库中Blast比对结果，可以将J1、J2鉴定为副干酪乳杆菌亚种。

2.3 乳酸菌的性能测定结果

2.3.1 乳酸菌的产酸能力 乳酸菌发酵脱脂奶粉产酸的能力是发酵酸奶优质菌株的重要指标。J1、J2乳酸菌的发酵脱脂奶粉产酸结果如表3，从表3可知，这两株菌株发酵酸奶时酸度都比较低，说明其发酵产酸的能力比较强，可能是潜在的优良菌株。

2.3.2 乳酸菌的耐酸能力 人体胃的pH介于1.5～20，因此能够耐受极端的pH是益生菌的另一个重要特征。图2简单地说明了J1、J2在pH 1.0、2.0、3.0的条件下1、2、3、4 h存活率。经过研究发现J1、J2在pH 3.0的条件下，1 h之后的存活率分别为70%、76%，4 h之后仍然有存活的菌株，并且在pH 1.0和2.0的条件下，4 h后也仍然有存活菌株，说明J1、J2具有一定的耐酸的能力。

2.3.3 乳酸菌的抑菌能力 经过抑菌试验发现J1、J2这两株菌株对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄（Staphylococcus aureus）具有很强的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到了15 mm以上，对大肠杆菌的抑菌圈直径甚至达到了30 mm以上（表4）。

3 小结与讨论

该研究从冷藏酱鸭中分离筛选到的2株菌株经过形态学、生理生化、16S rRNA序列鉴定为副干酪乳杆菌亚种，分别命名为J1、J2。通过对其性能的研究发现J1、J2具有很强的发酵产酸和抑菌的能力，并且具备一定的极端pH环境的耐受能力。另外，陈艳梅[15]从酸奶中分离到的乳酸菌发酵脱脂奶粉产酸的最低的pH是4.35，而J1、J2达到了4.30、4.36，说明J1、J2发酵产酸的能力与用于酸奶发酵菌株的发酵能力不差上下。同时，从抑菌试验结果中可以看出，J1、J2具有一定的抑菌能力，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑菌圈的直径达到了15 mm以上，对大肠杆菌的抑菌圈直径甚至达到了30 mm以上。Iyer等[14]报道过从米糕中分离到的2株抑菌能力强的菌株对大肠杆菌的抑菌圈的直径达到了9 mm以上，与之相比，J1、J2具有更强的抑菌能力。霍小琰等[16]从酸马奶中分离到了10株乳酸菌，并做了大肠杆菌的抑菌试验，其中抑菌圈直径最大是16.30 mm，进一步表明乳酸菌J1、J2的抑菌能力强。J1、J2还具有一定的耐受低pH的能力，可以在pH为1、2、3的条件下4 h之后仍能够存活，说明其能耐受低pH。总的来说，J1、J2具有发酵能力强、抑菌能力强、耐酸等特性，是两株优良的乳酸菌。

本研究从冷藏酱鸭中分离筛选到了2株副干酪乳杆菌亚种，其具有很强的发酵产酸、抑菌以及耐酸等能力，是优良的益生菌菌株，可用于发酵制品的研究。另外因J1、J2具有很强的抑菌能力，具有保藏酱鸭以及其他储藏食品的潜力。

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