丹酚酸B对高糖培养肾小管上皮细胞转分化的影响及意义*



丹酚酸B对高糖培养肾小管上皮细胞转分化的影响及意义*

**通信作者 E-mail:smjtyf@126.com

网络出版时间：2015-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150420.1847.012.html

张昌志， 石明隽**， 王圆圆， 刘丽荣， 肖瑛， 石春花， 严瑞， 郭兵

(贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨丹酚酸B对高糖诱导肾小管上皮细胞分化的影响及可能机制。方法： 体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK52E随机分为正常糖(NG)组、高渗(HM)组、高糖(HG)组和高糖+Sal B(HB)组，分别培养24 h；采用免疫酶细胞化学染色对NRK52E细胞进行鉴定，MMT法检测丹酚酸B对细胞生长活性的影响，免疫荧光细胞化学和Western blotting检测各组TGF-β1、E-caderin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表达。结果： 与NG组相比较，HG组肾小管上皮细胞中TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表达增多(P<0.05) ，而E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05) ；与HG组比较，HB组肾小管上皮细胞中TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表达减少(P<0.05) ，而E-cadherin蛋白表达增多(P<0.05) 。结论： 丹酚酸B对高糖诱导肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化(EMT) 有明显抑制作用，其机制可能是通过抑制TGF-β1的表达，改善了肾小管纤维化病变的发生发展。

[关键词]肾小管上皮细胞； 高糖培养； 丹酚酸B； 转化生长因子-β1； 上皮-间充质细胞转化

糖尿病肾病( diabeticnephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见而严重的并发症，进行性发展至可导致终末期肾衰竭。DN发病机制复杂，至今仍未充分阐明，而且治疗效果不佳。研究发现，在DN肾小管间质纤维化发展过程中，肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达显著上调，并通过激活Smads等信号通路，诱导肾小管上皮细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成增加并抑制其降解而过度沉积，从而造成广泛的肾组织纤维化。本实验前期研究表明，“丹芪合剂” 具有明显改善DN的功效，延缓了病变的进展，但疗效机制不甚清楚。丹酚酸B是丹芪合剂主药丹参的有效成分，具有抗炎、抗凋亡，改善微循环的作用[2-3]。本实验以大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象，探讨丹酚酸B(salvianolic acid B Sal B)对高糖条件下肾小管EMT的影响及其可能机制，以期为糖尿病肾病治疗药物的选择提供实验依据。

1材料与方法

1.1　材料和主要试剂

大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)，由上海复旦大学陆利民教授赠与。低糖培养基dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)，(美国Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶和青霉素链霉素(美国Gibco公司)，细胞培养皿(美国Corning公司)，丹酚酸B(贵州康成医药公司)，PVDF膜(Millipore，美国)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)，荧光(TRITC)标记羊抗小鼠IgG(苏州碧云天公司)，荧光(FITC)标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物公司)，抗α-SMA和抗TGF-β1 (美国Stan Cruz公司)，抗Col-Ⅳ (美国CST生物公司)，抗CK-18、抗E-cadherin和抗β-actin(北京博士德生物公司)。

1.2　肾小管上皮细胞培养及鉴定

用含有10% FBS的DMEM培养液培养NRK52E细胞，接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培养，待细胞生长达到90%时进行传代，倒置显微镜观察细胞形态。免疫酶细胞化学检测上皮细胞标志性蛋白CK-18。

1.3　丹酚酸B对NRK52E细胞活力的影响

将NRK52E细胞悬液以5×103/100 μL接种至96孔板，待细胞生长至80%，用无血清DMEM将细胞静止24 h，使细胞生长同步化，根据DMEM中丹酚酸B终浓度不同分为9组: 空白对照(C)组，阴性对照(H)组，0.1 μmol/L Sal B组，1 μmol/L Sal B组，5 μmol/L Sal B 组，10 μmol/L Sal B组，20 μmol/L Sal B 组和50 μmol/L Sal B 组和100 μmol/L Sal B组，每组设4个复孔，37 ℃、5% CO2孵育箱培养48 h后吸弃上清，每孔加5 g/L的MTT溶液10 μL继续培养4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，继续培养至显微镜下观察紫色结晶全部溶解。在全自动酶联免疫检测仪上，检测在570 nm处的吸光度值(实验重复3次)。

1.4　细胞分组与处理

将传代并静止后的细胞随机分为:(1)正常糖(NG)组：DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2% FBS 培养；(2)高渗(HM)对照组：DMEM(含糖5.5 mmol/L)+20 mmol/L D-Mannitol+2% FBS培养；(3)高糖(HG)组：DMEM(含糖25mmol/L)+2% FBS培养；(4)高糖+Sal B(HB)组：DMEM(含糖25 mmol/L)+ 2% FBS+Sal B(含Sal B10 μmol/L)培养，每组均培养24 h进行观察。部分细胞接种至放入盖玻片的6孔板进行细胞爬片培养，每一实验组均设3个复孔，细胞处理及分组如上，用于免疫酶细胞化学和免疫荧光细胞化学染色检测。

1.5　免疫酶细胞化学染色及免疫荧光细胞化学染色

接种至6孔板的细胞，生长融合度达80%时，更换为无FBS 的DMEM培养基培养24 h，使细胞生长同步，从孵育箱取出进行免疫酶细胞化学染色。具体过程如下：4%多聚甲醛室温固定30 min；0.1%TritonX-100打孔，室温20 min；3% H2O2浸泡抑制内源性过氧化物酶，室温20 min；用含10%小牛血清的PBS室温封闭40 min；吸尽液体后加入一抗CK-18(1∶50)、E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶100)，4 ℃过夜。次日，(1)免疫酶细胞化学染色：滴加即用型生物素标记的二抗，约80 μL/每孔，室温孵育30 min；使用DAB室温显色30 s～5 min；苏木素复染15 s；脱水，透明，晾干后，中性树胶封片；显微镜下观察并摄取图像。(2)免疫荧光细胞化学染色：滴加含1% BSA的PBS按1∶100稀释的浓缩型生物素标记二抗TRITC，37 ℃避光孵育30 min；滴加含3% BSA的PBS按1∶100稀释的浓缩型FITC标记二抗，37 ℃避光孵育30 min；滴加DAPI染核剂37 ℃避光孵育10 min，封片，避光保存；倒置荧光显微镜观察并摄取荧光图像。

1.6　免疫酶细胞化学染色

接种至6孔板的细胞，生长融合度达80%时，更换为无血清DMEM培养基培养24 h，使细胞生长同步，从孵育箱取出进行免疫荧光细胞化学染色。具体过程如下：细胞漂洗、固定、打孔、封闭如免疫酶细胞化学染色，一抗浓度E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶100)。次日，室温30 min，0.01 mol/L PBS洗涤3次，滴加含1% BSA的PBS按1∶100稀释的浓缩型生物素标记二抗TRITC，37 ℃避光孵育30 min；滴加含3% BSA的PBS按1∶100稀释的浓缩型FITC标记二抗，37 ℃避光孵育30 min；室温下PBS洗涤3次，滴加DAPI染核剂37 ℃避光孵育10 min，PBS洗涤，封片，避光保存；倒置荧光显微镜观察并摄取荧光图像。

1.7　Western Blotting检测

细胞蛋白裂解液裂解细胞，离心取上清液，用BCA试剂盒测蛋白浓度，加样缓冲液煮沸10 min使蛋白变性，上样，经SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜，加入α-SMA、E-cadherin和Col-Ⅳ一抗，浓度均为1∶1 000，TGF-β1 和β-actin浓度为1∶400，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1∶5 000) 室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影曝光，凝胶成像系统(Bio-Rad)扫描采集图片，QuantityOne软件分析。以β-actin为内参照，结果用目的蛋白TGF-β1 、α-SMA、E-cadherin及Col-Ⅳ与相应的β-actin灰度比值表示，即相对积分灰度值对TGF-β1 、α-SMA、E-cadherin及Col-Ⅳ蛋白半定量。

1.8　统计学处理

数据采用SPSS 17.0软件进行统计处理，以均数±标准差( mean±SD) 表示，各组数据差异比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1　CK-18蛋白表达

免疫酶细胞化学结果显示，在培养的NRK52E细胞中CK-18蛋白表达阳性，说明培养的细胞为大鼠肾小管上皮细胞,见图1。

阴性对照　　　　　 　　　　　　　　　　　CK-18图1　CK-18在NRK52E细胞中的表达 (SABC,×200)Fig.1　Expressions of CK-18 in NRK52E cells (SABC, ×200)

2.2　E-cadherin及α-SMA表达

免疫荧光细胞化学染色后，在同一个视野下切换不同的激发光发现，NG培养24 h的细胞E-cadherin表达丰富，而α-SMA表达极少；当细胞在HG环境下培养24 h E-cadherin表达降低，而α-SMA表达增多,见图2。

注: NG代表正常糖; HG: 代表高塘图2　糖处理24 h后NRK52E细胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表达(SABC，×200)Fig.2　Expression of E-cadherin and α-SMA protein in cultured renal tubular epithelial cells after incubated with normal glucose and high glucose medium for 24 h

2.3　丹酚酸B对肾小管上皮细胞活力的影响

MTT实验检测结果显示，100 μmol/L Sal B可增加细胞的相对活力，0.1~50 μmol/L范围内的Sal B 对NRK52E细胞活力无明显影响，提示上述浓度的Sal B对NRK52E无明显的细胞毒性作用,见图3。

图3　Sal B对NRK52E细胞活力的影响(MTT)Fig.3　The effects of Sal B on NRK52E cell viability

2.4　TGF-β1 、E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表达

Western Blotting结果显示，NG组与HM组之间TGF-β1 、E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表达差异无统计学意义，表明高渗对细胞生长无明显影响；与NG组比较，HG培养24 h TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白水平较NG组显著上调(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著下调(P<0.05)；与HG组比较，HB组TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表达下调(P<0.05) ，E-cadherin表达增加(P<0.05)。见图4。

图4　正常、高渗、高糖和高糖+Sal B(10 μmol/L) 处理24 h后NRK52E细胞中E-cadherin、TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白的表达(Western Blotting)Fig.4　Expression of E-cadherin, TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ protein in NRK52E cells after incubated with normal glucose, high mannitol, high glucose and high glucose plus Sal B for 24 h respectively

3讨论

DN是糖尿病最常见的严重微血管并发症之一，肾小球硬化和肾小管间质纤 维化为其主要病理特征，其发病隐匿，早期不易被发现，出现症状时肾脏的病变已经不可逆转，如不加以有效的控制，最终将发展为终末期肾病(end-Stage renal disease，ESRD)，发生肾衰竭，只能依靠血液透析或肾移植来维持生命。由于DM发病率逐年增高，DN已成为导致慢性肾衰竭的主要病因之一。然而，DN发病机制至今尚未完全阐明，且缺乏有效的治疗药物，已成为导致终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因。TGF-β1是目前已知的致纤维化作用最强的细胞因子，研究发现，在DN肾组织及高糖刺激的肾小管上皮细胞中，TGF-β1表达都显著上调，其可通过多条通路诱导肾小管上皮细胞向间质细胞的转分化(EMT)以及激活间质成纤维细胞，使肌成纤维细胞(myofiroflasr,MF)大量聚集并合成胶原等ECM，致使肾小管-肾间质纤维化进行性发展[4-5]。EMT是肾脏纤维化的中心环节，主要表现为肾小管上皮细胞原有的细胞表型发生改变，细胞间的紧密链接消失，E-cadherin表达减少，α-SMA重新表达，胶原蛋白表达增多[6-7]。本研究结果显示，高糖处理NRK52E 24 h后，TGF-β1表达显著增高，上皮细胞标志物E-cadherin表达明显降低，而间质细胞标志物α-SMA表达明显增高并伴有胶原等ECM的异常沉积，进一步证明高糖可通过上调TGF-β1的表达激活TGF-β1/Smads等信号通路，而诱导肾小管上皮细胞EMT的发生，促进肾小管-肾间质纤维化发生发展。

丹芪合剂是一种由丹参、黄芪、生地黄等中药组成的中药，具有活血化瘀，益气养阴，改善肾组织局部微循环，调节机体免疫力等功效。本研究结果表明丹芪合剂能显著改善糖尿病大鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量等肾功能指标，纠正糖尿病大鼠的血脂代谢紊乱，使糖尿病大鼠的肾重/体重比值降低，以及减轻肾小球基质增生、肾小管和肾间质损害，减少ECM的沉积，从而减轻和延缓肾小管间质纤维化发生发展，发挥肾脏保护作用[8-10]，但对其疗效机制及发挥治疗作用的有效成分尚未进行深入研究。丹酚酸B是丹参的有效成分，已有研究报道丹酚酸B在心血管疾病起着抑制细胞迁移、增生、扩散的作用，能有效的下调TGF-β1的表达，抑制ERK的磷酸化和血管紧张素Ⅱ受体的表达而发挥抗肝纤维化作用，也可减轻输尿管梗阻引起的肾脏纤维化程度[11-13]，亦有研究发现丹酚酸B可通过抑制TGF-β1诱导的EMT改变，发挥改善肺纤维化的作用[14]。本研究结果显示，高糖培养肾小管上皮细胞24 h以后，肾小管上皮细胞TGF-β1的表达量明显增加，E-cadherin蛋白表达显著减少，并伴有α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表达明显增多，表明肾小管发生了明显的EMT，而高糖培养肾小管上皮细胞予以丹酚酸B处理后，肾小管上皮细胞TGF-β1的表达量显著减少，E-cadherin和α-SMA蛋白的异常表达逆转，ECM的沉积减少，EMT程度明显减轻，提示丹酚酸B可能通过下调肾小管上皮细胞 TGF-β1蛋白表达水平，发挥其抑制EMT的作用。

综上所述，丹酚酸B对高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT有明显抑制作用，其机制可能是通过抑制TGF-β1的表达，减轻了肾小管纤维化病变的发生发展，研究结果对进一步明确丹芪合剂及其有效成分防治糖尿病肾病的具体作用机制提供了一定的实验依据。

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(2015-03-11收稿，2015-03-25修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

The Effect of Salvianolic Acid B on High-Glucose Induced Renal

Tubule Epithelial Cell Epithelial-Mesenchymal Transition

ZHANG Changzhi, SHI Mingjun, WANG Yuanyuan, LIU Lirong, XIAO Ying,

SHI Chunhua, YAN Rui, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Salvianolic acid B (Sal B) on the high-glucose induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in renal tubule epithelial cells and the possible mechanism. Methods: NRK52E cells, the rat renal tubular epithelial cells, were cultured in vitro. The cells were randomly divided into normal glucose group (group NG), high mannitol group (group HM), high glucose group (group HG) and high glucose and Sal B group (group HB), and each group was cultured for 24 h. Immunocytochemistry was used to identify the renal tubule epithelial cells. MTT was adopted to the effect of Salvianolic acid B on cell growth activity. Immunofluorescence cytochemistry staining was used to assess the protein expression of E-cadherin and α-SMA. Western blotting was used to detect the protein expression of TGF-β1, E-caderin, α-SMA and Col-Ⅳ under different conditions. Results: Compared with group NG, the protein expression of TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ increased significantly(P<0.05) while the expression of E-cadherin significantly decreased (P<0.05) in renal tubular epithelium after treated with high glucose for 24 h. Compared with group HG, in group HB, Sal B decreased the expression of TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ (P<0.05) and upregulated E-cadherin protein expression in renal tubular epithelium cells after treated with Sal B for 24 h (P<0.05). Conclusion: Sal B can significantly inhibit HG-induced expression of EMT through reducing the expression of TGF-β1, which may ameliorate occurrence and development of renal tubule fibrosis lesion.

[Key words]renal tubular epithelial cells; high-glucose; Salvianolic acid B; transforming growth factor betal; epithelial-mesenchymal transition

[中图分类号]R363

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)04-0337-05

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(编号：81360116)； 贵州省社会发展攻关项目[编号：黔科合SY字(2012)3088号]； 贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目[黔科]合中药字(2012)5037]