原花青素对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制*＊

张文艳，孙宝飞，余资江＊＊＊，余彦，肖朝伦，罗时鹏，令狐艳，杨丹

(1.贵阳医学院解剖学教研室，贵州贵阳550004;2.贵阳医学院附院呼吸内科，贵州贵阳550004)

松树皮提取物中含有大量原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)的化合物，OPCs具有抗炎、抗氧化及抗血小板聚集及改善学习记忆能力作用［1-3］。海马内核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在脑缺血后可被诱导激活，NF-κB通过调控多种基因的表达参与了多种细胞因子和炎症介质的转录调节，在缺血性脑损伤中具有重要作用。NF-κB作为脑缺血损伤的治疗靶点，对有效防治脑缺血炎症具有重要的理论和临床意义［4］。目前中药在治疗脑缺血炎症方面虽已有许多报道，但中药作用于NF-κB信号转导途径的研究还较少。本实验采用OPCs治疗缺血再灌注模型小鼠，探讨OPCs对缺血再灌注损伤后小鼠脑海马神经元的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年昆明种小白鼠120只，体重20～22 g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK(黔)2002-0001。按随机分组原则将120只小鼠分为正常对照组、假手术组、14 d模型组、14 d治疗组、28 d模型组和28 d治疗组，每组20只。饲养温度(20±2)℃，湿度48%～60%。

1.2 动物模型建立

各组小鼠常规饮食，术前12 h禁食，4 h禁水。小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，常规消毒，自下颌骨到胸骨柄间作5～8 mm长的颈部正中切口，游离双侧颈总动脉及伴行神经，夹闭双侧颈总动脉，缺血15 min，然后松开微动脉夹，恢复血液灌注15 min，反复3次造成小鼠脑缺血再灌注损伤，苏醒前小鼠保温。术后连续3 d给予青霉素2 000 000 U肌注抗炎，分笼饲养。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余操作同模型组。治疗组在处死前7 d给予OPCs(100 mg/kg)灌胃治疗，1次/d，正常对照组、假手术组、模型组灌注等量生理盐水。

1.3 海马组织炎症因子测定

每组取10只小鼠海马组织匀浆离心后取上清液，采用ELISA法测定肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)以及白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 海马CA3区NF-κB蛋白表达

Western blot法检测，每组各取10只小鼠断颈处死取出全脑分离出海马，切取双侧海马CA3区组织，称重，以1∶10加入4℃预冷的匀浆缓冲液后抽提核蛋白，恒温冷冻离心机4℃，14 000 r/min离心30 min，收集上清液，Bradford法测定蛋白含量，加等体积的2×电泳样品缓冲液混合，以1 g/L蛋白量上样，10%SDS-PAGE电泳分离后电转膜至硝酸纤维膜，膜片以5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(NF-κBp65单克隆抗体)4℃过夜，洗涤后与二抗-辣根过氧化物酶(HRP)交联物反应，强化学发光试剂(ECL)显色剂显色，以柯达医学专用胶片曝光，手工显影、定影、洗片，显现特定的蛋白信号条带。BIO-RAD生物图像处理系统(PDQUEST 6.1.1)进行灰度测定。按目的蛋白灰度值与相应β-actin灰度值计算每例标本相应指标的相对值。

1.5 统计学处理

数据用SPSS 11.5软件处理，数据结果用均数±标准差(±s)表示，数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模后观察到模型组小鼠出现惊厥、呼吸深慢、心跳加快等脑缺血模型特异性表现。表明造模成功。

2.2 海马组织中NF-α、IL-6蛋白表达

ELISA结果显示，假手术组与正常对照组结果无差异(P＞0.05)，各模型组小鼠TNF-α、IL-6蛋白表达水平明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05);模型组中，14 d组升高更明显，差异有统计学(P＜0.05)，各治疗组TNF-α、IL-6水平低于同期模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 海马组织CA3区NF-κB蛋白表达

假手术组海马CA3区NF-κB蛋白水平与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，各模型组NF-κB蛋白水平显著高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05);各治疗组低于同期模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图1。

表1 各组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表达Tab.1 The protein expressions of TNF-α，IL-6 and NF-κB in hippocampal tissues of mice in each group

图1 各组小鼠海马组织CA3区NF-κB蛋白表达(Western blot)Fig.1 Expressions of NF-κB in CA3 region in hippocampal tissues of mice in each group

3 讨论

脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)引起缺血组织一系列复杂的病理生理变化，涉及自由基产生、氧化应激、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、炎性细胞因子损害和细胞凋亡等多个方面。NF-κB是一类具有多向调节作用的核蛋白因子，当中枢神经系统缺血时，可被特异性激活，从而调控多种基因的表达，参与免疫、炎症、氧化应激、细胞凋亡等多种病理生理过程，与缺血再灌注损伤关系密切［5］。NF-κB存在于脑血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞中，是由p50和p65两个亚单位组成的异二聚体。NF-κB未激活时与抑制蛋白IκB结合后位于胞质，在某些刺激因素作用下IκB降解，并与NF-κB解离后被激活，进入胞核与特定基因启动子结合，调控基因的转录［6］。多种炎症递质基因的启动子和增强子中包含κB位点，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-12、血管细胞黏附分子-1、干扰素-γ等，这些因子促进炎症反应，最终促使神经细胞从早期缺血到细胞死亡的不可逆损害演变，加重脑损伤，炎性细胞因子在缺血再灌注后所引发的继发性损伤起关键作用［6］。

脑缺血早期TNF-α分泌的增加是缺血再灌注损伤形成的主要原因［7］，TNF-α又可诱导IL-6的合成。本研究证实脑缺血后NF-κB蛋白表达水平明显升高，14 d模型组高于28 d模型组，可能与机体自身修复有关，提示NF-κB是脑缺血再灌注损伤炎症机制中的一个关键性因子，在脑缺血中发挥重要作用。在脑缺血再灌注损伤后TNF-α、IL-6蛋白表达水平明显升高，提示脑缺血再灌注后损伤机制可能与此有关。

从松树皮中提取的OPCs是一种多酚类复合物，含量一般为80%左右，OPCs通过抗氧化、抗凋亡等途径发挥改善脑缺血再灌注损伤的作用［8-11］。李建玲等［12］研究发现，OPCs可以通过下调凋亡相关蛋白caspase-3对脑缺血产生保护作用。杨东斌［13］发现OPCs能够明显改善脑缺血再灌注损伤，IL-6和内皮素-1可能与其减轻炎症反应有关。本研究采用OPCs治疗脑缺血再灌注损伤小鼠后，蛋白印迹结果显示海马CA3区NF-κB蛋白水平与同期模型组比较均降低，炎性因子TNF-α和IL-6水平均较同期模型组小鼠低，说明OPCs治疗对核因子NF-κB的表达具有明显的抑制作用，对小鼠缺血再灌注产生了一定的保护作用。提示如能通过某些方法、途径或药物来抑制NF-κB的激活，可有效地预防和治疗脑缺血再灌注损伤。抗NF-κB产生可能为预防和治疗脑缺血再灌注损伤提供一个新的思路和途径。

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［12］李建玲，何斌，李琳琳.原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2011(6):463-466.

［13］杨东斌，原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中TL-6和ET-1的影响［J］.中国实用神经疾病杂志，2013(9):44-45.