小鼠肠缺血再灌注诱发多器官功能障碍的动物模型研究*＊

郑德义，王毅，杜娇，李平洋，肖向阳，程代薇，李自力

(贵州省人民医院烧伤整形科，贵州贵阳550002)

肠道缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion，II/R)损伤是严重创(烧)伤后常见的病理生理过程，肠缺血再灌注不仅引起肠损伤，而且导致机体其他器官如肺、肝及肾脏等多器官损害［1］，发生多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至多器官衰竭死亡。国内文献多以大鼠、兔等较大型啮齿动物为实验对象［2-3］，且肠缺血及再灌注时间不一，本研究以小鼠对实验对象，探索建立稳定的II/R诱发MODS实验动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物分组

10周龄健康雄性C57BL/6小鼠72只，体重22～26 g，根据观察指标随机分组。分组1:肠缺血30 min组、40 min组、50 min组和60 min组，每组12只，手术后7 d时观察肠缺血不同时间小鼠的生存率。分组2:假手术组(Sham，6只小鼠)，肠缺血40 min后再灌注组(II/R，18只小鼠)，分别于再灌注1 h、6 h和12 h(各6只)时取标本。实验经过医院伦理学委员会批准。

1.2 方法

参照文献［4］实验，所有小鼠术前禁食12 h，自由饮水，腹腔注入1%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)麻醉，开腹钝性分离肠系膜前动脉，用动脉夹夹闭肠系膜前动脉(SMA)造成小鼠肠缺血，缺血相应时间后松开动脉夹恢复血流再灌注，关闭腹腔;假手术组不夹闭SMA(仅开腹后关闭腹腔)。术后立即腹壁皮下注入生理盐水1 mL，自由进饮食。

1.3 检测指标

观察分组1中的48只小鼠7 d内的生存率，分组2中的24只小鼠分别于相应时间，心脏穿刺抽血，室温静置、离心(4 000 g/min)15 min分离血清，-80℃保存，统一检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Crea)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;肠缺血再灌注后6 h取右上肺叶、肝及肾脏组织做病理学检查。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 II/R小鼠生存率

观察肠缺血再灌注后7 d内动物生存状况，随着肠缺血时间延长，小鼠生存率明显降低。在观察期内，肠缺血30 min小鼠全部存活，缺血40 min动物生存率60%，缺血50 min小鼠生存率仅50%(在82 h半数动物死亡)，肠缺血60 min小鼠生存率＜40%(在6 h时半数动物死亡)。与肠缺血30 min比较，肠缺血50 min和60 min组小鼠死亡率明显增加(P＜0.05)，见图1。

图1 不同肠缺血时间小鼠的生存率Fig.1 Mice survival rate in differentischemia time groups

2.2 血清ALT、AST、Crea和LDH

小鼠肠缺血再灌注1 h时，仅有Crea指标高于假手术组(P＜0.01)，肠缺血后再灌注6 h，4项血清学指标均明显高于假手术组(P＜0.01);而在12 h血清指标中仅有ALT及AST明显高于假手术组(P＜0.01)。结果提示，小鼠肠缺血再灌注损伤所引起的MODS在手术后6 h是最为显著，是最佳时间点。见表1。

2.3 肺、肝和肾组织改变

假手术组小鼠肺、肝脏及肾脏组织形态正常。II/R后6 h肺、肝脏及肾脏发生病理改变，主要肺组织充血，肺间质炎性细胞浸润;肝细胞水样变性、气球样变性，部分有炎性细胞浸润;肾小管上皮细胞水肿(图2)。

表1 肠缺血后不同再灌注时间血清生化指标变化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

表1 肠缺血后不同再灌注时间血清生化指标变化±s)Tab.1 The serum biochemical index changes in different reperfusion time after ischemia

(1)与sham比较，P＜0.01

再灌注时间1 h 6 h 12 h ALT(u/L)40.25±2.63 56±20.07 179.5±141.59(1)128.33±89.67(1)生化指标sham 1910.33±369.85 AST(u/L)195.75±57.53 156.67±22.37 483.33±176.31(1)365±117.29(1)Crea(mmol/L)5.25±0.96 17.67±12.58(1)10.33±1.86(1)8.00±2.65 LDH(u/L)1496.75±382.85 1406.33±1136.55 3119±947.58(1)

图2 各组小鼠肺、肝和肾组织学表现(HE，×100)Fig.2 The pathological change of lung，liver and kidney induced by II/R

3 讨论

肠缺血再灌注是严重创伤、烧伤体克后救治过程中可能发生的一个共同的病理生理阶段。肠缺血再灌注损伤后肠黏膜屏障受损及功能下降、促使肠道细菌及内毒素移位，氧自由基损害、中性粒细胞活化和各种炎性细胞因子的过度合成及释放，诱发全身炎性反应，导致肺、肝、肾脏等远隔脏器的损害［1］，是ARDS和MODS发生的重要原因［5-6］。研究II/R损伤的发病机制，首先建立稳定、可靠的实验动物模型是关键。

本实验表明，随着肠缺血时间增加，动物存活率逐渐降低，肠缺血60 min组小鼠，再灌注6 h时半数动物死亡，显然不适合作为研究模型。肠缺血时间40～50 min小鼠在1周观察期内，半数以上存活，是较为理想的肠缺血时间。因此，选择肠缺血40 min后再灌注1 h、6 h及12 h时，观察肝、肾及全身组织器官功能损伤情况及血清AST、ALT、LDH及Crea水平。LDH几乎存在于所有器官组织细胞内，是有机体能量代谢过程中参与糖酵解的重要酶，当组织器官发生病变时，细胞膜通透性增加，释放更多的LDH到细胞间隙和体液，LDH水平是反应细胞膜损伤较灵敏的指标之一，是目前比较公认测定细胞膜损伤的指标［7］。本研究发现，小鼠肠缺血再灌注1 h时血清学指标仅有Crea高于假手术组，提示此时再灌注造成的损伤并不明显;12 h时血清学指标仅有ALT和AST高于假手术组，提示再灌注12 h时组织器官的修复功能可能部分恢复;再灌注6 h时血清学4项指标明显高于假手术组，而且病理检查提示，肠缺血后再灌注6 h，肺、肝脏及肾脏发生改变，主要表现组织细胞水肿、变性，伴随炎症细胞浸润，提示小鼠缺血再灌注6 h是观察MODS模型的最佳时间点。模型制作过程中，因小鼠体形小，要求手术操作熟练、轻柔、精细，减少腹腔脏器的翻动，术中、术后注意保温，缺血期间断缝合或蚊式钳夹闭暂时关闭腹腔，以防肠组织及腹腔体液外渗。

综上所述，应用阻断小鼠肠系膜上动脉40～50 mim再灌注6 h，既能保证动物生存率，满足实验要求，又能形成肠道及远隔器官损伤及功能障碍，为进一步研究肠缺血再灌注诱发MODS发病机制的提供依据。

［1］Harward TR，Brooks DL，Flynn TC，et al.Multiple organ dysfunction after mesenteric artery revascularization［J］.J Vasc Surg，1993(18):459-469.

［2］朱枝祥，陈丁丁.肠系膜动脉缺血再灌注诱发多器官功能障碍综合征模型研究［J］.抗感染药学，2010(2):93-96.

［3］宋富波，杨牟，车海杰.兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立［J］.青岛大学医学院学报，2010(2):166-170.

［4］郑德义，王建明，贾一韬，等.p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠肠缺血再灌注肺损伤中的作用［J］.第二军医大学学报，2010(3):254-257.

［5］Takayama M，Ishibashi M，Ishii H，et al.Effects of neutrophil elastase inhibitor(ONO-5046)on lung injury after intestinal ischemia-reperfusion［J］.JAppl Physiol，2001(4):1800-1807

［6］Yao Y，Yu Y，Wu Y，et al.The role of gut as a cytokine-generating organ in remote organ dysfunction after intestinal ischemia and reperfusion［J］.Chin med J，1998(6):514-518.

［7］王敏，俞诗源，刘佳昕，等.X射线辐射对小鼠肾组织中乳酸脱氢酶、Na+-K+ATP酶活性及caspase-3蛋白、Bax蛋白表达的影响［J］.甘肃农业大学学报，2014(2):41-47.