膜辅助蛋白在自然流产中的表达及其生物学意义

彭　鲁, 高玲娟, 钟天鹰

(1. 南京医科大学附属脑科医院, 江苏 南京 210029;

2. 南京医科大学附属南京市妇幼保健院, 江苏 南京, 210004)

膜辅助蛋白在自然流产中的表达及其生物学意义

彭鲁1, 高玲娟2, 钟天鹰2

(1. 南京医科大学附属脑科医院, 江苏 南京 210029;

2. 南京医科大学附属南京市妇幼保健院, 江苏 南京, 210004)

摘要:目的探讨膜辅助蛋白(MCP)在自然流产中的表达及其生物学意义。方法采用Real-time PCR和免疫印迹技术检测MCP基因的mRNA和蛋白质表达水平；采用流式细胞术检测滋养层细胞的凋亡率，Transwell小室法评估滋养层细胞的侵袭能力。结果MCP在自然流产蜕膜组织中显著低于人工流产的蜕膜组织；抑制MCP基因表达显著增加滋养层细胞凋亡，且滋养层细胞侵袭能力显著减弱。结论MCP在滋养层细胞凋亡中发挥重要作用，并可能由此导致自然流产的发生。

关键词:膜辅助蛋白; 自然流产; 滋养层细胞; 凋亡

自然流产是产科常见病理妊娠之一，其病因复杂。除解剖、内分泌、感染、染色体、遗传因素外，其中40%～80% 原因不明的自然流产可能与免疫因素有关[1]。已有研究[2]表明，自然流产的发生与蜕膜组织细胞凋亡异常以及补体系统的过度激活有关，但目前对于滋养层细胞表面凋亡调控蛋白在蜕膜组织中的表达和内在调节机制缺乏系统并深入的研究。膜辅助蛋白(MCP)是重要的补体调节蛋白之一，主要功能是抑制补体激活,从而保护宿主细胞免受补体系统的溶解破坏[3]。本实验旨在探讨MCP在滋养层细胞凋亡以及诱发自然流产中的关系及其可能的机制。

1材料与方法

1.1　材料

滋养层细胞株HTR-8/SVneo由杭州赫贝生物有限公司提供，siRNA由武汉晶赛公司合成。收集2009年1月—2011年12月南京医科大学附属南京妇幼保健院30例自然流产及人工流产蜕膜组织，取材后立即置于-80°C冻存备用。

1.2　细胞培养

将细胞接种于完全营养液中，每50 mL培养瓶中含5 mL完全营养液(含15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，非必需氨基酸10 ml/L及MEM，pH 7.2)，置于37 ℃, 5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁生长，于3 d后换液，去非贴壁细胞此后每3 d换液1次，当传代的细胞布满瓶底时，3～4 d可继续传代。

1.3　siRNA (small interference RNA，小干涉RNA)的设计

根据Invitrogen网站(http: //rnaidesigner. Invitrogen. com/sirna)提供的免费软件设计合成MCP siRNA特异性干扰片段和阴性对照片段。从目标基因开放阅读框起始密码子“ATG”下游75至100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列作为潜在的siRNA靶位点。选择GC含量在35%～55%的靶基因序列作为潜在优选，在Genebank数据库进行Blast分析与其他基因的同源性。将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，以排除和其他编码序列同源的序列，确定其为特异性序列。

1.4　实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)

PCR反应体系为20 μL含1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、0.1 μmol/L荧光标记探针、引物各0.2 μmol/L。实时荧光PCR反应在ABI Prime 7300定量PCR检测仪上进行，反应参数为50 ℃/2 min，95 ℃/3 min, 95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测。选择荧光检测模式FAM荧光，对于实验数据，以下公式进行计算：2-ΔΔCT=2-(CT.gC1qR- CT.actin)Time x + (CT.gC1qR- CT.actin)Time 0.

1.5　免疫印迹

所有蛋白样品调至等浓度后上样，取下电泳玻璃夹板，将切好的硝酸纤维素膜置于甲醇5 min，然后置于转移缓冲液中平衡15 min；将膜从电转槽中取出，室温下摇动封闭60 min。将硝纤膜置于一抗稀释液中，在摇床上37 ℃孵育2 h，将膜放进5 mL相应二抗稀释液中(按相应比例稀释, 1∶5 000稀释)，室温轻摇1 h。加入显色液，轻轻晃动定影液定影；用自来水将经过定影处理的X胶片洗净，晾干。以Bio-Rad凝胶成像分析仪进行灰度扫描，对于实验数据，以下公式进行计算：目的蛋白/内参蛋白。

1.6　细胞凋亡检测

胰酶消化对数期细胞，调节其浓度为(1～5)×106/mL, 500～1 000 r/min离心5 min, 弃去培养液。用预冷, 4 ℃无菌的PBS充分洗涤细胞2次，用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞。用100 μL的细胞悬液重悬细胞，于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI溶液，混匀后室温下避光孵育10～15 min。孵育后加入400 μL结合缓冲液，立即上流式细胞仪分析(实验必须在1 h内完成)。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的带通滤器(band pass filter)检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。

1.7　细胞迁移实验

采用 Corning公司8 μm孔径的聚碳酯膜Transwell小室(24孔板 )，在 Transwell小室的下室中预先加600 μL含20% FBS的RPMI 1640培养基, 37 ℃平衡1 h，细胞用 PBS洗3次；消化后重悬于含10% FBS的RPM I 1 640培养基中，取细胞悬液100 μL加入至上室。37 ℃、 5%CO2条件下培养24 h，取出Transwell小室，用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的细胞；PBS冲洗后用4%福尔马林固定，行Giemsa染色，显微镜(×200)下随机计数滤膜下表面5个视野的细胞数，以迁移细胞的数目来表示细胞的迁移能力。

1.8　统计学方法

所得数据以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　MCP在自然流产和人工流产蜕膜组织中的表达水平

采Real-time PCR和免疫印迹法检测脱膜组织中MCP mRNA和蛋白的表达水平。结果显示，自然流产脱膜组织中MCP的mRNA和蛋白质水平分别为(0.32±0.11)和(0.22±0.09)，较人工流产脱膜组织中的(0.91±0.07)和(0.62±0.12)显著减少(P<0.05)。

2.2　沉默MCP基因对滋养层细胞凋亡及侵袭能力的影响

MCP siRNA载体和空质粒载体转染滋养层细胞48 h后，结果显示， MCP siRNA组细胞凋亡细胞为(42.39±2.41)，较空载体组(10.53±1.11)显著增多，而滋养层细胞侵袭能力为(11.1±1.2)，较空载体组(32.5±2.4)显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

MCP又称做补体抑制蛋白CD46，其染色体定位于人类1号染色体短臂的32号区，其分子量大小约48～56 ku, 含有4个同源序列(scr)，是一种跨膜蛋白，广泛分布于组织细胞表面。MCP作为一种重要的补体调节蛋白，主要功能是作为辅助因子促进I因子介导C3b，C4b的降解，抑制补体C3激活的联级反应，被认为是抑制补体旁路激活的最有效的因子[4-5]。作为防止补体系统过度活跃的主要调节蛋白，补体调节蛋白在防止细胞损伤过程中起着相当大的作用。Girardi等[6]发现Crry基因敲除的小鼠胎儿可以导致小鼠死亡(小鼠Crry基因与人类的MCP作用相似)，并认为原因可能是补体沉积以及由此导致的胎盘感染。

妊娠的成功与否是由多重因素决定的。胎盘蜕膜作为母胎的界面，蜕膜细胞能分泌多种细胞因子，对胚胎着床、妊娠建立与维持，以及分娩发动均起着极为重要的作用。任何破坏胎盘蜕膜细胞因子分泌平衡状态的原因,都可能给妊娠造成不良影响,引起流产[7]。在本实验中，发现自然流产妇女胎盘蜕膜组织中的MCP含量明显减少，提示自然流产的发生可能与MCP蛋白表达降低有关，沉默MCP基因，滋养层系凋亡率显著增加，且侵袭能力显著减弱[8-10]。提示失去MCP保护的细胞更容易凋亡，自然流产的发生可能是由于大量胎盘胎膜组织细胞凋亡的结果[11-12]。

综上所述，MCP有望成为评估自发性流产发生风险的一个重要指标[13-14], 对其展开进一步深入研究，掌握其特点可能会为临床医生早期发现流产危险，尽早采取措施保护母胎健康提供一种新的方法。

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Expression of membrane cofactor protein in

patients with spontaneous abortion and its

biological significance

PENG Lu1, GAO Lingjuan2, ZHONG Tianying2

(1.NanjingBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210002;

2.NanjingMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedical

University,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression of membrane cofactor protein (MCP) in patients with spontaneous abortion and its biological significance. MethodsThe expression of MCP mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blot, and meanwhile the effect of MCP on the placenta decidual tissue was measured by Transwell, and the apoptosis rate of trophoblast cell was evaluated by FCM. ResultsThe results showed that the expression of MCP on placenta decidual tissue reduced significantly in patients with spontaneous abortion, while the suppression of MCP might reduce the apoptosis rate and invasion ability of trophoblast cell. ConclusionThe expression of MCP plays an important role in apotosis of trophocyte, which might be the cause of the spontaneous abortion.

KEYWORDS:membrane cofactor protein; spontaneous abortion; trophocyte; apotosis

通信作者:高玲娟, E-mail: gaolingjuan@njmu.edu.cn

收稿日期:2015-03-09

中图分类号:R 714.21

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)19-055-03

DOI:10.7619/jcmp.201519016