帕金森致病基因LRRK2的研究进展

刘崴，张本恕(天津医科大学总医院，天津300052)

帕金森致病基因LRRK2的研究进展

刘崴，张本恕
(天津医科大学总医院，天津300052)

摘要:帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病。随着对PD发病机制的研究深入，发现遗传因素在PD发病中起着越来越重要的作用。其中LRRK2不仅是常染色体显性遗传PD最常见的原因，且在散发PD发病中起重要作用。本文对LRRK2基因的基本特征、功能特点、各种突变形式及该基因致PD发病机制的研究进展进行综述。

关键词:帕金森病; LRRK2基因;基因突变

帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病。65岁以上人群中发病率高达1%。PD患者有运动和非运动症状，多巴胺治疗仅提供短暂的缓解且不能减慢疾病的进展。14%的PD患者有家族史，一般认为PD是多基因病，由基因和环境相互作用所致。随着对PD发病机制研究的深入，研究人员发现遗传因素在PD发病中起着越来越重要的作用。目前发现与PD明确有关的致病基因有5个，分别是α-synuclein、Parkin、DJ-1、PINK1和LRRK2基因。其中LRRK2不仅是常染色体显性遗传PD最常见的原因，且在散发PD发病中起重要作用［1］。因此关于LRRK2基因的基本特征、功能特点、各种突变形式及其调控机制的研究逐渐成为热点。现对该基因与PD的研究进展综述如下。

1　LRRK2的结构与分布

LRRK2又名Park8，位于第12号染色体，p11.2～13.1，长约144 kb，编码2 527个氨基酸，是大分子蛋白，相对分子质量286 kD，由高度保守的ROCO蛋白、富含亮氨酸重复序列(LRR)、Ras蛋白复合体(ROC)、Ras蛋白C-末端重复序列(COR)、MAPKKK结构域(即激酶结构域)和色氨酸(W)天冬氨酸(D)重复序列区(每个重复序列由40个色氨酸和天冬氨酸组成，又称WD40区域)组成。LRR和WD40存在N-末端重复，提示具有类似支架蛋白的功能。LRR结构域主要调节蛋白质间的互相作用; ROC和COR结构域具备GTP酶活性，在Ras介导的细胞转变、细胞破裂、黏着作用的组成及MAPK信号通道中起主要作用;激酶结构域与下游蛋白质的磷酸化有关; WD40区域是一个在进化上高度守旧的区域，主要参与蛋白质间的相互作用，可与多种蛋白可逆性结合，亦参与运输和信号传导过程［2］。

LRRK2不仅在中枢神经系统高度表达，在肺、肾和白细胞中表达更高，且LRRK2的表达随着年龄增加而增加［3］。研究发现在啮齿类动物脑部尾状核、皮层的表达量很高，在黑质相对低一些。且LRRK2仅在神经细胞中表达，胶质细胞未发现其表达。这点与先前的mRNA研究一致。LRRK2mRNA除在尾状核和皮层含量高以外，在嗅结节、伏隔核、海马、小脑中亦存在，黑质中含量相对较低。最近研究人员又发现LRRK2蛋白在隔核、丘脑、下丘脑、乳头体核、脑干和室下区表达显著。LRRK2主要存在于多巴胺能投射区，最近的研究发现改变多巴胺传送对纹状体D2受体缺失显著或黑质多巴胺能神经元缺失PD患者的LRRK2mRNA表达无效果;而对单胺能囊泡缺失小鼠LRRK2mRNA含量表达亦无效。有研究显示，在经左旋多巴治疗MPTP所致帕金森绒猿后诱发肌张力障碍后，脑中LRRK2mRNA含量增加［4］。关于多巴胺运输改变对LRRK2蛋白的作用仍未知。LRRK2在许多非多巴胺区域表达提示其在细胞中存在某种基本功能。提示我们LRRK2功能损伤会导致特定的细胞易损性增加。

2　LRRK2　的定位

在许多细胞系转染中，大部分LRRK2位于细胞质的不同部位，可能与线粒体相联系。虽然LRRK2不包含任何的疏水穿膜结构或线粒体及核的靶序列，但亚细胞分级提示LRRK2在膜上和微粒体上。另外LRRK2被发现位于脂筏上即细胞膜和膜细胞器的的微结构域。如高尔基体、浆膜、突触囊泡、线粒体和内质网。原代鼠细胞培养亦证实LRRK2位

于膜结构。在成年啮齿类动物脑组织中亦发现LRRK2位于微粒体、突触小泡和突触细胞溶质等有膜结构［5］。LRRK2位于膜和膜器官上，很可能通过调节突触小泡合成、运输或调节膜结构来实现突触调节功能［2］。

3　LRRK2　突变

LRRK2突变主要集中在该蛋白的中心区，包括ROCGTP酶结构域、MAPKKK结构域和COR结构域。ROCGTP酶结构域存在一个碱基位点，可出现多个突变(R1441C，R1441G，R1441H); COR结构域有一个突变(Y1699C);mAPKKK结构域有两个相邻的碱基突变(G2019S和I2020T)。相反在酶结构域外的突变目前用孟德尔遗传方式还没有证实无关。这些均提示酶的活动在疾病发病中起重要作用。体外研究显示发生在RocGTP酶结构域和COR结构域的突变可降低GTP酶活性［6］。然而在体外研究中纯化的全长LRRK2仅有微弱的GTP酶活性，提示在细胞内酶的活性需辅助蛋白。相反，MAPKKK结构域的G2019S突变可增加激酶活性［7］。研究表明G2019S是LRRK2最常见突变，6%～8%的家族型PD和1%～2%散发PD由其引起。WD40域的G2385R和COR结构域的R1628P突变对酶活性无影响。I2020T突变在部分模型中可促进4E结合蛋白(4EBp)磷酸化［8］，然而其他的检测发现其对激酶活力无影响。因此相同区域的不同突变有着不同的作用机制，这可能是选择的方法不同导致不同结果。以上数据表明LRRK2激酶和GTP酶活性在疾病发病机制中起重要作用。体内外实验提示导致LRRK2激酶失活和GTP酶结合缺陷的突变较其野生型毒性要小。

大部分LRRK2蛋白存在可与其他蛋白结合的序列，因此LRRK2起着脚手架作用，对信号传导有重要作用。研究人员已证实LRRK2完全或部分通过Roc域与集合的微管蛋白、蓬蛋白、CHIP共伴侣蛋白结合。有丝分裂素激活蛋白激酶(MAPPK)激酶6(MKK6)与COR激酶(调节细胞内相互作用)域结合。LRRK2是磷酸蛋白，通过富含亮氨酸重复序列的氨基末端位点与14-3-3蛋白家族相互作用可能解释LRRK2的多种突变影响相同蛋白的原因。例如，ROC和COR区突变导致与14-3-3蛋白结合力下降，然而在激酶区G2019S突变却没有这种作用［9］。这提示该突变与其他突变发病机制不同。

4　LRRK2　功能

野生型LRRK2可调节神经元发育中的轴突生长，控制和维持轴突长度［10］;与Rab5a相互作用参与囊泡胞吞作用［11］;树突和轴突之间的囊泡归类［12］;与FADD相互作用激活凋亡［13］及通过4EBP1的磷酸化和与微小RNA(microRNA)通路相互作用控制蛋白翻译来调节蛋白合成［14］。有研究报道LRRK2可与α和β微管蛋白相互作用，表明其还有维持细胞骨架动态作用［15］。潜在的LRRK2抑制剂H-1152可加强LRRK2在微管上附着，这表明二者的相互作用由激酶调控［16］。

LRRK2同时具有激酶域和GTP酶域，二者存在调节作用;其中ROC结构域具备GTPase激酶活性，属于开关蛋白，通过与GTP联结活化、水解失活间的转变来调节LRRK2的激酶活性;提示ROC结构域是LRRK2发挥功能的调节中心，是潜在的药物调节靶点，与临床治疗有密切联系［17］。MAPKKK是信号转导进程中的重要因子，属于较大的酪氨酸激酶类蛋白亚族(MLKs)。GTP酶和MAPKKK参与多条信号传导通道的上游调节，与部分蛋白质分子的磷酸化与去磷酸化相关，位于神经信号传导级联的上游，LRRK2基因该结构域的相关突变或许会扰乱这些信号的准确传导，导致PD及其他神经退行性疾病的产生。

激酶域和GTP酶域可能通过二聚体的形式结合，许多蛋白酶和Ras-GTP酶均为二聚体。研究发现在人淋巴母细胞系中内源性LRRK呈聚合体形式。体外研究亦报道外源性LRRK2的聚合能力涉及多个结构域的互换。然而目前支持激酶域聚合的研究仍缺乏。ROC域能独立发生作用或与LRRK2的中心结构ROC-COR-酶相互作用，这种作用可被WD40加强。ROC-ROC相互作用并不依赖核苷酸，但可被R1441C突变削弱。这表明LRRK2聚合体的不稳定可导致LRRK2GTP酶异常。LRRK2Ⅱ171Ⅴ突变可支持上述说法，但该突变是在年长的对照人群中发现的良性突变［18］。

最初的计算机模型提示LRRK2突变可以增加激酶活性。神经变性疾病大都存在异常的磷酸化且LRRK2突变可导致多样的病理，因此以激酶活力作为基因治疗的靶点不仅可用于PD亦可用于其他神经变性疾病。LRRK2Ras-GTP酶同Ras相关GTP酶家族序列同源，高度保守包括GTP结合和水解。Retromer LRRK2Ras-GTP酶在GTP结合体(激活)及GDP结合体(失活)之间转换形成了一个环路。LRRK2Ras-GTP酶通过这两种形式的转换来调节不同的细胞信号传导。这个过程由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTP酶激活蛋白(GAPs)来辅助［6］。ROC突变可降低GTP酶活性表明该处突变可延长

LRRK2GTP酶的活性状态。结晶结构显示激活的GTP酶结构域有一个特有的折叠二聚体，ROC突变可打破这个三级结构，从而支持上述猜想［19］。LRRK2激酶的活性需要GTP酶来激活。结合非水解的GTP类似物可促进LRRK2的磷酸化，这表明LRRK2的激活可通过自己的GTP酶激活分子内的MAPKKK。R1441C/G突变可能通过延长RRK2GTP酶的活性状态加强激酶活力。

LRRK2通过泛素—蛋白酶体途径降解，而不是通过自噬—溶酶体途径降解［20］，在体外实验中过度表达LRRK2可引起蛋白聚集及神经退行性变。在HEK293细胞系中，转染了LRRK2野生型及G2019S、Y1699C及R1441C的一部分细胞发生聚集。在神经节细胞SH-SY5Y细胞系中及在小鼠E15/16原代皮层细胞可以观察到LRRK2野生型出现神经退变;然而在发生R1441C、G2019S、Y1699C突变的原代细胞培养中，退变显著增加且伴随细胞凋亡［21］。与上述结果一致，在Cos-7细胞中LRRK2包涵体的形成及凋亡细胞明显增多。FADD和caspase-8是外源的细胞死亡途径中的两个关键蛋白，研究发现，LRRK2可与含有死亡结构域(DD)的FADD、TRADD、RIP1相互作用［22］。在原代培养的神经元中，抑制FADD的功能及使caspase-8表达沉默可阻碍LRRK2介导的细胞凋亡，提示FADD/ caspase-8信号途径在LRRK2介导的神经元死亡中起重要作用。LRRK2PD突变体的激酶活性上升是导致神经元死亡的重要原因，提示控制LRRK2的激酶活性是治疗PD的一种策略［23］。

5　LRRK2　突变致PD的发病机制

LRRK2突变相关的PD患者与其他典型的PD患者在临床表现上无差别，其病理变化呈现出多样性的特点，既可以有lewy小体，亦可以有Tau蛋白的聚集等。尸检时发现部分患者的Lewy小体中LRRK2蛋白阳性，推测LRRK2在lewy小体的形成中可能通过与alpha synuclein蛋白相互作用产生病理变化。在携带有突变LRRK2蛋白的PD患者中会出现Tau蛋白阳性的神经纤维缠结样病理改变。另外有的患者中既无Lewy小体，亦无神经纤维缠结。相对于alph synuclein蛋白主要出现于Lewy小体中，Tau蛋白主要出现在神经纤维缠结，而LRRK2蛋白的免疫细胞化学无特异的、神经变性的病理变化［23］。因此LRRK2突变可出现在PD、阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)和路易体痴呆。

α-突触核蛋白(α-syn)是Lewy体的主要成分。由常染色体隐性遗传PD的致病基因: Parkin、PINK1和DJ-1突变导致的PD神经元中缺乏Lewy小体(LBs)，提示其发病是由于线粒体功能受损所致。而α-突触核蛋白(α-syn)和LRRK2是常染色体显性遗传PD的致病基因，一般有LB病理改变，α-syn是其主要成分。研究发现，不同的LRRK2突变导致不同的发病路径。这可能是因为LRRK2作为信号蛋白，作用于α-突触核蛋白和其他蛋白的上游，在神经变性病中，突变导致蛋白沉积在残存神经元中［9］。

Lewy小体中的α-突触核蛋白是高度磷酸化的，体外研究亦表明磷酸化的α-突触核蛋白更易聚集，表明这种磷酸化的α-突触核蛋白异常增多可诱发神经变性。LRRK2是激酶，可使α-突触核蛋白磷酸化，但只有1项研究支持这个观点，该项研究是在过度表达LRRK2的HEK293细胞裂解物中发现重组的α-突触核蛋白直接磷酸化，而在细胞中及动物模型中均无α-突触核蛋白证据支持上述观点。有1项研究报道LRRK2可经细胞外信号调节的激酶通路调节α-突触核蛋白表达，但作用不大［24］。Qing等［25］在不同病理组织的路易小体及遭受氧化应激的HEK293细胞上成功地免疫共沉淀LRRK2和α-突触核蛋白。提示在应激情况下二者定位于相同的细胞器，参与共同的生物过程并且LRRK2可直接或间接影响α-突触核蛋白的磷酸化状态。

多项研究亦表明，α-突触核蛋白以α螺旋结构与膜相互作用，而LRRK2亦与膜相互作用。二者均参与突触囊泡回收及与脂筏相互作用。脂筏是膜微结构，用作细胞内信号传导。这些结构需要特异的支架蛋白，而LRRK2具有支架蛋白功能，可通过蛋白—蛋白间相互作用结构域(WD40和LRR)调节异源性相互作用。突变可损伤LRRK2组织脂筏的能力，对α-突触核蛋白与脂筏相互作用产生直接影响。LRRK2和α-突触核蛋白在微管动态平衡和轴突运输方面亦有联系。很多研究已证实LRRK2可引起tau蛋白高度磷酸化从而打破微管平衡最终错误地运输结合α-突触核蛋白的囊泡使蛋白聚集，诱发细胞死亡。最后突变的LRRK2如R1441C，可削弱自体吞噬功能促进α-突触核蛋白聚集［26］。

除了磷酸化外LRRK2还可通过其他机制加剧α-突触核蛋白的毒性。LRRK2表达导致微管动态平衡、高尔基体和线粒体受损。敲除LRRK2可减轻这些表现。虽然这些数据建立了LRRK2和α-突触核蛋白的联系，但是否也发生在中脑的多巴胺能神经元中仍不得而知，有待进一步研究。

综上所述，LRRK2作为神经细胞内高表达的

一种蛋白，可能作为一种激酶，参与细胞内多种途径的信号转导，病理条件下可能参与α-突触核蛋白及Tau蛋白的磷酸化和聚集。其激酶的特异性底物和上下游通路及各种突变对它们的影响有待进一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-07)

文章编号:1002-266X(2015)33-0094-04

文献标志码:A

中图分类号:R745

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.038