非糜烂性反流病患者食管上皮细胞钙黏蛋白的表达及细胞间隙的改变

刘荣泉，傅奕，郑英，陈浮，徐晓铃，乔敏，朱海杭(扬州大学临床医学院，扬州苏北人民医院，江苏扬州500;扬州大学医学院)

非糜烂性反流病患者食管上皮细胞钙黏蛋白的表达及细胞间隙的改变

刘荣泉1，傅奕2，郑英2，陈浮1，徐晓铃1，乔敏1，朱海杭1
(1扬州大学临床医学院，扬州苏北人民医院，江苏扬州225001;2扬州大学医学院)

摘要:目的探讨非糜烂性反流病(NERD)患者食管上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)的表达变化及细胞间隙的改变。方法采用免疫组化染色法检测43例份NERD食管下段上皮组织与26例正常食管下段上皮组织中的E-cadherin，在光镜下观察切片并采集图像，采用图像分析系统测量细胞间隙。结果E-cadherin在NERD食管上皮组织中异常表达36例(失表达4例、不完整性表达32例)，异常表达率83.7%;在正常食管上皮组织中异常表达5 例(失表达0例、不完整性表达5例)，异常表达率19.2%;二者相比，P＜0.01。NERD患者食管鳞状上皮细胞间隙［(1.23±0.04)μm］大于正常食管鳞状上皮细胞间隙［(0.68±0.06)μm］，二者相比，P＜0.01。结论E-cadherin 在NERD患者食管上皮组织中低表达，导致细胞间隙增宽，可能是NERD发病的机制之一。

关键词:胃食管反流;上皮细胞钙黏蛋白;细胞间隙;免疫组织化学

非糜烂性反流病(NERD)是指具有反流症状，而内镜下没有食管黏膜异常表现的一种常见慢性病。美国一项互联网调查的流行病学资料显示，成年人胃食管反流病(GERD)发病率达26%，而NERD占GERD的70%左右［1］。NERD的发生与抗反流屏障功能失调有关，包括下食管括约肌松弛、食管内反流物清除障碍、食管黏膜防御能力下降等。上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)为细胞间连接的重要组成部分，与紧密连接蛋白(TJ)相连，共同维持细胞功能［2，3］。食管鳞状上皮细胞间隙增宽是NERD的早期形态学表现，可为正常人细胞间隙的2～3倍。本文对NERD患者食管上皮组织中E-cadherin的表达变化及鳞状上皮细胞间隙的改变进行研究，以探讨其与NERD的关系。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料2013年3～9月苏北人民医院收治的有反流、胸痛等症状的患者43例，均经胃镜及病理学检查诊断为NERD。其中，男25例、女18例，年龄25～77(52.2±13.4)岁。另选择无反流症状非GERD者26例作对照，男13例、女13例，年龄35～65(51.8±9.4)岁。均在距离食管下端3～5 cm处取上皮组织标本活检。

1.2E-cadherin检测采用免疫组织化学染色En-Vision法(二步法)。组织标本用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片、脱蜡，梯度乙醇至水，PBS(pH 7.4)冲洗3次，微波法热抗原修复，柠檬酸(pH 6)缓冲液，3% H2O2去离子水37℃孵育10 min。PBS冲洗3次，除去PBS液，每张切片加1滴E-cadherin抗体(博士)，冰箱4℃过夜，PBS冲洗3次，除去PBS液，每张切片加1滴E-cadherin Anti-Rabbit IgG，温箱37℃孵育60 min，PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察1～3 min。自来水冲洗，苏木素复染1 min，自来水冲洗返蓝。切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察其表达部位及类型。结果判断: E-cadherin正常表达于上皮细胞，呈完整的胞膜表达;镜下见棕黄色颗粒状为其表达阳性，以染色强度分别计0～3分(无染色计0分、轻度染色计1分、中等染色计2分、强染色计3分)，再以细胞膜完整表达、不完整表达＜50%、不完整表达≥50%、失表达分别计3、2、1、0分，两项得分相加，0分为失表达，1～3分为不完整性表达，4～6分为完整性表达，失表达与不完整性表达为E-cadherin异常表达。

1.3细胞间隙测量另取切片行HE染色后，选取基底上层或棘层的细胞核居中、核仁明显的细胞，光镜(×400)观察并采集图像。采用盲法对每例切片随机选择10个不同视野共取10张照片，采用IPP图像分析系统每张相片测量10个细胞间隙，计算测量得到的100个细胞间隙的平均值，然后计算平均值。

1.4统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，比较采用t检验;计数资料以百分比表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1E-cadherin在NERD食管上皮组织与正常食管上皮组织中的表达比较E-cadherin在NERD食管上皮组织中异常表达36例(失表达4例、不完整性表达32例)，异常表达率83.7%;在正常食管上皮组织中异常表达5例(失表达0例、不完整性表达5例)，异常表达率19.2%;二者相比，P＜0.01。

2.2NERD食管鳞状上皮与正常食管鳞状上皮细胞间隙比较NERD食管鳞状上皮细胞间隙为(1.23±0.04)μm，正常食管鳞状上皮细胞间隙为(0.68±0.06)μm，二者相比，P＜0.01。

3　讨论

食管黏膜防御主要为上皮屏障，由细胞膜、桥粒蛋白(DP)和TJ组成，TJ由跨膜蛋白、胞质附着蛋白、细胞骨架蛋白相连组成［4］。E-cadherin是钙依赖性黏附蛋白家族中的重要成员，是黏着连接的一个组成部分，与TJ、DP共同维持细胞屏障;其基因位于第16号染色体长臂，为跨膜黏蛋白，其羧基末端驻留在细胞质中，而氨基末端位于细胞间隙，在Ca2+参与下通过胞质连环素与细胞骨架蛋白相连，介导细胞间及细胞与细胞外基质的黏附作用;在建立和维持上皮组织细胞间连接阻力及渗透性中起主要作用［5］。Jovov等［5］研究发现，缺乏E-cadherin蛋白的白鼠模型中食管黏膜存在细胞间隙增宽，说明E-cadherin蛋白与食管黏膜的细胞间隙增宽有一定关系。

在病理情况下，如炎性因子作用，酸碱、胆汁刺激等，可引起食管上皮E-cadherin分布异常、表达减少甚至溶解，影响其功能，破坏上皮细胞间的极性和完整性，细胞间的黏附作用减弱或消失，导致细胞间隙增宽，进而使内皮层通透性升高［6］。反流性食管炎和NERD食管黏膜细胞间隙都存在增宽［7］，其通透性增大［8］。有研究认为上皮细胞间隙增宽是NERD的客观结构指标［9］。经质子泵抑制剂治疗后，NERD食管黏膜上皮细胞间隙可恢复正常［10］。

本研究发现，与正常对照者相比，NERD食管上皮组织中E-cadherin异常表达率高，为蛋白量下降或失表达所致，这与国外报道［5］结果相符;且细胞间隙增宽明显，与正常对照者相比差异有统计学意义。因此，从分子学基础上可以认为NERD发病与E-cadherin的异常表达有关。从本研究结果来看，NERD患者由于E-cadherin表达异常，导致细胞连接结构和功能异常，细胞间隙增宽，使得黏膜通透性升高，H+、胃蛋白酶、胆汁酸等易透过上皮层，作用于黏膜下的神经末梢，从而引起烧心、反酸、胸痛等症状。因此，NERD的发生可能与E-cadherin表达异常，使得细胞间隙增宽，细胞间通透性增高有关。

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·综述·

(收稿日期:2014-09-25)

文章编号:1002-266X(2015) 21-0088-02

文献标志码:B

中图分类号:R571

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.036