2型糖尿病肾病患者肾组织中Snail、MYH9的表达及意义

王晴，韩鸿玲(天津医科大学总医院，天津300052)

2型糖尿病肾病患者肾组织中Snail、MYH9的表达及意义

王晴，韩鸿玲
(天津医科大学总医院，天津300052)

摘要:目的观察锌指转录因子(Snail)、非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(MYH9)在2型糖尿病肾病(DN)患者肾活检组织中的表达，探讨DN的发病机制。方法收集DN肾组织标本32例(DN组)和非DN行肾活检的正常肾组织标本10例(对照组)，应用免疫组化法检测两组肾组织中Snail、MYH9的表达。结果Snail阳性染色见于DN组和对照组肾小管上皮细胞，其相对表达量前者高于后者(P＜0.05) ; MYH9阳性染色见于DN组肾小球足细胞和肾小管，对照组未见阳性表达; DN组纤维化的肾小球、肾小管中未见Snail、MYH9阳性表达。结论Snail、MYH9在DN患者肾组织中表达增加，提示Snail、MYH9可能参与了DN的发生发展过程。

关键词:糖尿病肾病;锌指转录因子;非肌肉肌球蛋白重链ⅡA;免疫组织化学

近年来研究发现，上皮细胞-间充质细胞转化(EMT)在2型糖尿病肾病患者肾间质纤维化的发生发展中起着不容忽视的作用［1］。Snail属于锌指转录因子Snail超家族成员，Snail基因在正常胚胎发育和肿瘤侵袭、转移的EMT中起重要作用［2］。非肌肉肌球蛋白重链ⅡA (MYH9)主要表达于近曲小管、肾小球足细胞和系膜细胞［3］，其在肾组织中异常表达、定位或功能改变都会导致肌球蛋白异常，使得足细胞和肾小管的细胞骨架受损，进而发生EMT［4］。作为调节EMT关键的转录因子，Snail、MYH9是否参与2型糖尿病肾病的发病报道较少。本研究观察2型糖尿病肾病患者肾组织中Snail、MYH9的表达变化，并探讨其临床意义。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2008年8月～2013年3月经临床和病理学检查确诊的2型糖尿病肾病患者的肾组织标本32例(DN组)，男18例、女14例，年龄22 ～73(45.2±12.0)岁，体质量指数19.0～24.9 (23.2±4.0) kg/m2，空腹血糖4.0～6.7(5.2± 0.7) mmol/L，血肌酐32～70(56.1±8.8)μmol/L。同期选择行肾活检非糖尿病肾病患者的正常肾组织标本10例(对照组)，男4例、女6例，年龄23～55 (37.5±9.4)岁，体质量指数18.5～24.7(23.0± 5.6) kg/m2，空腹血糖3.5～5.8(4.8±0.7) mmol/L，血肌酐39～68(54.7±10.0)μmol/L。两组均排除严重感染、心肝肺脑疾病及严重糖尿病代谢紊乱者。两组性别、年龄构成、体质量指数、空腹血糖等比较差异无统计学意义(P均＞0.05)。

1.2Snail、MYH9检测全部标本经4%中性甲醛固定、乙醇逐级脱水、二甲苯透明处理后石蜡包埋，制成4 μm厚组织切片。采用免疫组化SP法。将石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS冲洗3×5 min，过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3×5 min，微波热修复抗原，冷却至室温后PBS冲洗3×5 min，正常山羊血清室温下封闭30 min，分别滴加一抗抗体Snail(1∶250)、MYH9(1∶75)，4℃过夜，次日晨恢复至室温，PBS冲洗3×5 min，滴加过氧化物酶标记的链霉卵白素，置于湿盒中37℃下孵育30 min，PBS冲洗3×5 min，二氨基联苯胺对比染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用PBS代替一抗做空白对照。在光学显微镜下观察切片，每张切片随机读取10个不重叠含完整肾小球的视野，用Image-Pro Plus 5.1拍照存档并进行定量分析。将切片染色强度和染色细胞数量转化成累积光密度(IOD)值，IOD值越大提示免疫反应越强，取其均值表示Snail、MYH9在肾组织中的相对表达量。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料采用珋x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组Snail表达比较Snail在DN组、对照组中均表达，主要表达于肾小管上皮细胞细胞核，肾小球足细胞中有少量表达。DN组中Snail的相对表达量(81 130.06±14 697.45)显著高于对照组(2 167.60±300.01) (P＜0.05)。

2.2两组MYH9表达比较MYH9在DN组中表达，主要表达于肾小球足细胞、肾小管。对照组上述部位均无MYH9表达。DN组肾组织中MYH9的相对表达量(9 441.05±4.78)显著高于对照组(33.84 ±4.04) (P＜0.05)。

2.3DM组纤维化肾组织中Snail、MYH9的表达Snail、MYH9在萎缩的肾小管中表达量明显降低，甚至不表达;在纤维化的肾小球、肾间质中不表达。

3　讨论

2型糖尿病肾病患者肾脏病理变化包括细胞外基质积聚、基底膜增厚、系膜基质增加，最终发展成肾小球硬化、小管间质单核细胞浸润和纤维化［5］。肾小球硬化和肾小管间质纤维化是2型糖尿病肾病发展至终末期肾脏病的重要形态特征;肾小管间质纤维化的严重程度与2型糖尿病肾病病情进展和预后有关。在肾脏损伤过程中，多种因子可诱导上皮细胞转化为成纤维细胞肌成纤维细胞，引起肾小管缺失与细胞外基质蛋白沉积，这一过程称为EMT［6，7］。研究证实EMT在肾小管间质纤维化过程中发挥重要作用［8］。

Snail是调节EMT的关键转录因子，其直接作用的靶基因为E-cadherin。Snail主要以锌指区域与E-cadherin启动子上的E-box序列结合，抑制E-cadherin转录，使上皮细胞间丧失紧密黏附性，触发EMT［9］。本研究发现正常肾组织肾小管上皮细胞中Snail少量表达，而2型糖尿病肾病患者肾小管上皮细胞Snail表达明显增加，肾小球组织中亦有少量表达;且随着疾病进展，肾小球、肾小管纤维化后Snail不再表达，提示Snail促进肾小管上皮细胞EMT，参与了糖尿病患者肾损伤的病理过程，与Ohnuki等［10］研究结果一致。当足细胞受到损伤时可以发生EMT［11］; Zhang等［12］的研究也证实，2型糖尿病肾病患者足细胞的上皮细胞标记物E-cadherin的表达显著下降，而间充质细胞标记物α-SMA及Snail表达上调，说明足细胞发生了EMT。因此推测Snail同时参与肾小球、肾小管病变，促进EMT，从而导致2型糖尿病肾病。

MYH9是由MYH9基因编码的蛋白，在肾组织中异常表达、定位或功能改变都会导致肌球蛋白异常，使得足细胞和肾小管的细胞骨架受损，进而发生EMT，导致患者出现蛋白尿、血尿、肾衰竭［4］。当足细胞发生EMT时，其上皮细胞样表型标记物表达下调，而间充质细胞样表型标记物表达上调［13］。本研究发现正常肾组织中MYH9不表达，2型糖尿病肾病患者肾组织中MYH9表达增加，主要表达于肾小球足细胞、肾小管;随着2型糖尿病肾病病情进展，肾组织纤维化后MYH9表达消失。Ghiggeri等［14］研究发现个体MYH9基因突变，在电镜下表现为局灶足细胞足突消失，足细胞裂孔隔膜缺失，提示MYH9基因突变可引起局部肾小球足突融合，足细胞裂孔膜消失、肾小管骨架受损，诱发EMT，从而导致肾间质纤维化。

综上所述，Snail、MYH9在2型糖尿病肾病患者肾组织中表达增加，而在纤维化的肾小球、肾小管中不表达。Snail、MYH9可能通过诱发EMT参与2型糖尿病肾病肾间质纤维化。

参考文献:

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(收稿日期:2014-12-12)

通信作者:韩鸿玲

文章编号:1002-266X(2015)21-0035-03

文献标志码:B

中图分类号:R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.013