p16INK4A、Ki-67检测在宫颈液基细胞学疑难病例鉴别诊断中的应用

林俊汕，郑娜芬，曾宇婷，黄绮亭，区瑞章，叶梓莹，李海刚

(1增城市人民医院，广东增城511300；2中山大学孙逸仙纪念医院)

p16INK4A、Ki-67检测在宫颈液基细胞学疑难病例鉴别诊断中的应用

林俊汕1，郑娜芬2，曾宇婷1，黄绮亭1，区瑞章1，叶梓莹1，李海刚2

(1增城市人民医院，广东增城511300；2中山大学孙逸仙纪念医院)

目的 探讨p16INK4A、Ki-67检测在宫颈液基细胞学疑难病例鉴别诊断中的临床应用价值。方法 宫颈细胞学诊断疑难病例54例，其中绝经25例；液基细胞学技术(TCT)初诊后制片，进行p16INK4A、Ki-67免疫细胞化学检测。结果 反应性不成熟鳞状化生18例，p16INK4A、Ki-67均为阴性表达，组织活检或TCT复查均未见上皮内病变；ACS-H或HSIL 11例，p16INK4A、Ki-67阳性表达分别为11例和10例，病理活检证实为CINⅡ或CINⅢ。25例绝经患者中上皮萎缩鳞状7例，p16INK4A、Ki-67均阴性，活检结果或TCT复查未见上皮内病变或恶性病变；HSIL 12例，p16INK4A、Ki-67均阳性，病理活检CINⅢ 8例、鳞癌4例；鳞癌6例，p16INK4A、Ki-67均阳性，病理活检结果均为鳞癌。结论 TCT结合免疫细胞化学在诊断疑难宫颈细胞学病例中具有重要临床意义，p16INK4A、Ki-67对非上皮内病变和上皮内瘤变有鉴别诊断价值。

液基细胞学技术；免疫细胞化学；p16INK4A；Ki-67；宫颈疾病

宫颈癌是继乳腺癌之后的女性第2高发肿瘤[1,2]。近年来，随着宫颈液基细胞学技术(TCT)的应用，宫颈癌的发病率和病死率大大降低[3,4]。然而，TCT存在一定的假阴性和假阳性，造成一部分高危患者的漏诊或过度治疗[5]。此外，由于受到标本性状、制片水平、阅片经验的限制，尤其在某些情况下一些良性和恶性细胞形态存在一定程度的相似性，鉴别时会很困难，因此需要更加客观的辅助方法以提高细胞筛查的敏感性和特异性。本研究旨在探讨在TCT涂片上进行p16INK4A、Ki-67免疫细胞化学染色对宫颈细胞学疑难病例(怀疑癌变)的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年2月～2013年10月中山大学孙逸仙纪念医院收治的宫颈细胞学诊断疑难(怀疑癌变)患者54例，年龄21～72岁，绝经25例，未婚13例、已婚未育10例、已婚已育31例。

1.2 检查方法 所有患者TCT初诊后制片，行免疫细胞化学染色检查进一步诊断。TCT为ThinPrep®新柏氏涂片检查，细胞学诊断以2001年版TBS诊断报告模式为标准。应用TCT初诊出有疑难的病例，将其第1次制片后剩余的细胞用TCT制备薄片1张，潮干置于95%乙醇中固定15 min，室温下3% H2O2覆盖10 min，采用即用型快捷免疫细胞化学两步法染色，DAB显色镜下控色，PBS取代一抗作为阴性对照，已知阳性细胞作为阳性对照。p16INK4A为胞质和胞核着色，以阳性细胞≥10%为阳性；Ki-67为胞核着色，以阳性细胞≥1%为阳性，分布特点为局灶或弥漫分布[6]。

2 结果

29例镜下细胞成团或个别单个存在，数量较多，胞核增大，核大小不一，可见核仁，染色质淡染或稍深染，见插页Ⅱ图4A。根据细胞形态判定为反应性不成熟鳞状化生18例，p16INK4A、Ki-67均为阴性表达，组织活检或TCT复查均未见上皮内病变；ACS-H或HSIL 11例，p16INK4A、Ki-67阳性表达分别为11例、10例，病理活检证实为CINⅡ或CINⅢ。

25例绝经患者镜下见在萎缩的鳞状上皮背景中分布一些团片状细胞，核不大但核质比增大，染色质较深染，无或有肿瘤素质背景，容易与萎缩混淆，见插页Ⅱ图4B。根据细胞形态判定为上皮萎缩鳞状7例，p16INK4A、Ki-67均阴性，活检结果或TCT复查未见上皮内病变或恶性病变；12例为HSIL，p16INK4A、Ki-67均阳性，病理活检CINⅢ 8例、鳞癌4例；鳞癌6例，p16INK4A、Ki-67均阳性，病理活检结果均为鳞癌。

3 讨论

在大量临床实践中我们总结出当几种情况出现时，会给宫颈细胞学诊断带来困难。首先是反应性不成熟鳞状化生有可能误诊为ACS-H或HSIL。反应性不成熟鳞状化生细胞成团或个别单个存在，数量可以较多，胞核增大，核大小不一，可见核仁，染色质淡染或稍深染，具有一定非典型性，特别是当制片整体染色较深时，细胞核的染色程度更深，与ACS-H或HSIL容易混淆。我们曾在此方面出现过误诊，将出现数量较多的反应性不成熟鳞状化生细胞的病例诊断为ACS-H或HSIL，但多次宫颈活检未见上皮内病变或恶性病变。另外一种会给诊断带来困难的是绝经病例，当在明显萎缩的鳞状上皮细胞中出现一些团片状细胞，核不大但核质比增大，且染色质较深染，特别是在肿瘤素质背景不明显时，加上当工作量大、阅片速度较快时可能造成漏诊。

p16INK4A是细胞周期调节蛋白—依赖激酶的抑制物，是肿瘤抑癌基因的产物，90%以上的宫颈癌，包括鳞癌、腺癌、原位腺癌及高级别鳞状上皮内瘤变p16INK4A高表达，在低级别和正常及反应性的鳞状上皮中常为局灶弱阳性或阴性表达[7～11]。Ki-67反映细胞增殖活性，高表达是细胞增殖活跃的重要标记。正常宫颈鳞状上皮内Ki-67阳性细胞数目较少，主要分布在基底层[12]。随着宫颈病变的发展，Ki-67的阳性细胞也随之变化，CIN级别愈高，Ki-67的阳性细胞核越多，因此测定Ki-67蛋白可用于判断宫颈病变的进展及其严重程度[10～16]。

本研究将TCT诊断疑难病例进行p16INK4A、Ki-67免疫组化染色，结果显示18例反应性不成熟鳞状化生的p16INK4A、Ki-67均阴性，11例HSIL中两者阳性表达分别是11、10例。细胞学诊断与活检结果相符。反应性鳞状上皮化生的是一种生理性改变，主要发生在鳞柱交界处宫颈内膜侧，在化生的早期，储备细胞增生，这种细胞核圆形、增大，核质比增大，有可能被误诊为CIN。但鳞状上皮反应性增生和不成熟鳞状上皮化生p16INK4A阴性，Ki-67阳性常局限在鳞状上皮组织的基底层。本研究中25例可疑上皮内瘤变的绝经患者p16INK4A、Ki-67免疫细胞化学结果显示，萎缩鳞状上皮的两者均阴性表达，HSIL及鳞癌均阳性表达。鉴于Ki-67能在基底层细胞表达，实际应用中应该结合细胞形态，将Ki-67阳性表达数≥1%判断为阳性表达。

综上所述，在宫颈细胞学诊断实际工作中，对细胞形态介于鳞状上皮内瘤变和反应性不成熟鳞状化生，或在绝经萎缩背景中出现疑似上皮病变的病例建议制片行p16INK4A、Ki-67检测。将细胞形态结合免疫细胞化学阳性结果进行综合诊断，以提高宫颈细胞学诊断的准确性。

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李海刚，E-mail: 13728089120@126.com

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B

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2014-08-25)