丙泊酚对脑缺血再灌注大鼠脑组织Homer-1a表达的影响及其机制

沈大川，董斌，温超

(1铁岭市中心医院，辽宁铁岭112001；2大连医科大学附属第一医院)

丙泊酚对脑缺血再灌注大鼠脑组织Homer-1a表达的影响及其机制

沈大川1，董斌2，温超2

(1铁岭市中心医院，辽宁铁岭112001；2大连医科大学附属第一医院)

目的 观察丙泊酚对脑缺血再灌注大鼠脑组织Homer-1a表达的影响，并探讨其机制。方法 雄性SD大鼠120只，随机分为假手术组、造模组、丙泊酚组，每组40只。模型组、丙泊酚组线栓法建立脑缺血再灌注模型，假手术组仅行血管分离处理不插入线栓；造模后30 min，丙泊酚组腹腔注射丙泊酚10 mg/100 g，假手术组和对照组均腹腔注射等体积生理盐水。给药处理3 h、24 h、72 h、7 d分别进行神经功能评分，采用Real-time PCR法检测脑组织Homer-1a mRNA，应用酶联免疫吸附法检测血清S-100β。结果 与假手术组比较，模型组和丙泊酚组4个时间点神经功能评分、血清S-100β水平均增加(P均<0.05)，以模型组增高更显著(P均<0.05)。与假手术组相比，模型组在3、24 h时间点脑组织Homer-1a mRNA降低(P均<0.05)；丙泊酚组4个时间点脑组织Homer-1a mRNA均较其他两组升高(P均<0.05)。在所有大鼠样本中，脑组织Homer-1a mRNA表达与血清S-100β呈负相关(r=-0.939，P<0.01)。结论 丙泊酚麻醉可通过诱导脑组织Homer-1a mRNA表达发挥对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用，该作用可能与其降低血清S-100β水平有关。

缺血再灌注损伤；脑组织；丙泊酚；Homer-1a基因；S-100β；大鼠

研究发现，麻醉药通过扩张脑血管、降低脑组织代谢、抑制自由基合成、减缓脂质过氧化反应、调控神经递质等不同途径，发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用[1～3]。丙泊酚作为一种新型静脉麻醉药，具有起效快、输注后无蓄积、苏醒迅速而完全、不良反应少等特点，已广泛应用于临床。研究发现，丙泊酚具有一定的脑保护作用[4,5]，但其作用机制尚未完全阐明。Homer蛋白属于突触后密度蛋白质家族，其中Homer-1a是该家族中第1个被确认的蛋白，经神经元兴奋、突触形成或重塑性增加等神经活动诱导而快速短暂表达[6,7]。已有研究表明，Homer蛋白可抑制缺血后神经细胞损伤[8]。2013年9月～2014年5月，本研究观察丙泊酚对脑缺血再灌注大鼠脑组织Homer-1a表达的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠120只，体质量200～250 g，由大连医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理方法 按随机数字法将大鼠分为假手术组、模型组、丙泊酚组，每组40只。模型组、丙泊酚组大鼠术前禁食过夜，应用2%戊巴比妥钠按40 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉。手术分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，于颈总动脉分叉处下方1 mm处向颈内动脉方向插入直径0.25 mm的线栓，插入长度约18 mm。线栓插入过程中有阻力感，并且大鼠出现呼吸频率及心率加快、尿失禁等表现，可认定出现脑缺血。缺血1 h后拔出线栓，恢复大脑中动脉血供，即再灌注。假手术组仅进行血管分离处理，不插入线栓。造模后30 min，丙泊酚组腹腔注射丙泊酚10 mg/100 g(Sigma-Aldrich)，假手术组和模型组均腹腔注射等体积生理盐水。

1.2.2 神经功能评分 分别于药物处理3 h、24 h、72 h、7 d参照Zea Longa等[9]方法对各组大鼠进行神经功能评分：无明显异常表现计0分，左侧Honer征计1分，左侧前爪不能完全伸直计2分，向左侧转圈计3分，向左侧倾倒计4分，死亡计5分。

1.2.3 血清S-100β检测 分别于药物处理3 h、24 h、72 h、7 d眼眶静脉毛细管取血2 mL，分离血清，-80 ℃冰冻保存，1周内检测。采用S-100β酶联免疫检测试剂盒(上海拜力生物科技有限公司)检测血清S-100β水平，操作步骤按说明书进行。

1.2.4 脑组织Homer-1a mRNA检测 分别于药物处理3 h、24 h、72 h、7 d断头法急性处死各组大鼠，开颅后切取术侧水肿脑组织，-80 ℃冰冻保存，1周内检测。应用TRIzol试剂(Invitrogen)提取脑组织总RNA；应用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)ver 3.0试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对RNA样本进行逆转录获得cDNA；参照试剂盒说明书进行Real-time PCR扩增。Homer-1a上游引物5′-CAAACACTGTTTATGGACTG-3′、下游引物5′-TGCTGAATTGAA-TGTGTACC-3′，β-actin上游引物5′-GCAGAAGGAG-ATCACTGCCCT-3′、下游引物5′-GCTGATCCACATC-TGCTGGAA-3′。反应条件为：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、20 s，40个循环。实验至少重复3次，采用2-ΔΔCT法对脑组织Homer-1a mRNA进行统计分析。

2 结果

脑缺血再灌注大鼠模型建立过程中，8只大鼠死亡，将剩余72只造模成功大鼠随机分入模型组和丙泊酚组，每组36只，每个时间点取9只进行实验。假手术组40只大鼠全部存活，每个时间点取10只进行实验。

2.1 各组神经功能评分比较 见表1。

注：与假手术组同时点比较，*P<0.05；与模型组同时点比较，#P<0.05。

2.2 各组血清S-100β比较 见表2。

注：与假手术组同时点比较，*P<0.05；与模型组同时点比较，#P<0.05。

2.3 各组脑组织Homer-1a mRNA比较 见表3。

注：与假手术组同时点比较，*P<0.05；与模型组同时点比较，#P<0.05。

2.4 脑组织Honer-1a mRNA表达与血清S-100β的关系 相关性分析结果显示，在所有大鼠样本中，脑组织中Homer-1a mRNA表达与血清S-100β水平呈负相关(r=-0.939，P<0.01)。

3 讨论

脑组织具有高代谢率的特点，缺血导致缺氧可影响神经元代谢，造成严重神经组织损伤。近年来，越来越多的麻醉药物被用于缺血缺氧性脑损伤的治疗，发挥了良好的脑保护作用。本研究结果也进一步验证了丙泊酚具有抗脑缺血性损伤的脑保护作用。对于麻醉药物的抗脑缺血性神经损伤的保护作用机制，早期研究认为与其减少生理电活动从而降低代谢率有关。但近年的研究发现，与麻醉药物阻止缺氧时钠、钙离子变化，抑制谷氨酸的毒性损伤能力及其抗脑缺血缺氧损伤的保护作用相关。

Homer-1a属于短片段Homer家族蛋白。研究[10～12]发现，敲除Homer-1a基因的小鼠表现出神经精神功能异常；大鼠脑挫伤后Homer-1a蛋白表达降低，Homer-1a蛋白参与脑损伤修复过程；说明Homer-1a在缺血性脑损伤的发生、发展进程中发挥重要作用。本研究发现，丙泊酚可提高缺血再灌注大鼠脑组织Homer-1a mRNA表达，说明丙泊酚的脑保护作用可能与其调节Homer-1a水平有关。

研究发现，通过与mGluR、IP3R和NMDA受体等Homer相关蛋白结合，Homer-1a参与代谢性氨基酸受体信号转导调节以及多巴胺信号通路的调节，从而发挥其作为负向调节蛋白的作用[13～16]。但在脑保护过程中，Homer-1a的作用机制尚未完全阐明。本研究同步检测血清S-100β水平。S-100β是公认的早期脑组织缺血缺氧性损伤的金标准[17]。结果发现模型组、丙泊酚组血清S-100β水平均较假手术组显著升高，但丙泊酚组升高幅度不及模型组；在所有大鼠样本中Homer-1a与S-100β呈负相关。以上结果说明Homer-1a可能通过拮抗S-100β的作用而发挥其脑保护作用。

总之，丙泊酚麻醉可通过诱导脑组织Homer-1a mRNA表达发挥对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用，该作用可能与其降低外周血S-100β水平有关。

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Effect of propofol on expression of Homer-1a in cerebral ischemia reperfusion rats and the mechanism

SHENDa-chuan1,DONGBin,WENChao

(1TielingCentralHospital,Tieling112001,China)

Objective To observe the effect of propofol on the expression of Homer-1a in the brain tissues of cerebral ischemia reperfusion rats, and to explore its mechanism. Methods A total of 120 male SD rats were randomly divided into the sham operation group, model group and propofol group, 40 rats in each group. Cerebral ischemia reperfusion rat models were established in the model group and propofol group by using the suture method; sham operation group only

vascular separation processing, without line bolt insertion. Thirty min after modeling, rats in the propofol group were given propofol 10 mg/100 g by intraperitoneal injection, while rats in the sham operation and control groups were injected the same amount of normal saline. After the drug treatment for 3 h, 24 h, 72 h and 7 d, neurological function score was evaluated, Homer-1a mRNA level in the brain tissues was detected by using the real-time PCR, and S-100β in the peripheral blood was detected by enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with the sham operation group, the neurological function scores and S-100β levels of peripheral blood were increase at the four time points in the model and propofol groups (allP<0.05), and the model group increased more significantly (allP<0.05). Compared with the sham operation group, the level of Homer-1a mRNA decreased in the model group at the time points of 3 h and 24 h (allP<0.05). The Homer-1a mRNA level of the propofol group was higher than those in the other two groups at the four time points (allP<0.05). In all rat samples, Homer-1a mRNA expression level and S-100β level was negatively correlated (r=-0.939,P<0.01). Conclusion Propofol anesthesia has a protective effect on the brain tissues in the cerebral ischemia reperfusion rats by inducing Homer-1a mRNA expression, and this effect may be related to the decrease of S-100β level in the peripheral blood.

ischemia reperfusion injury; brain tissues; propofol; Homer-1a gene; S-100β; rats

国家自然科学基金资助项目(81371454)。

沈大川(1971-)，男，副主任医师，研究方向小儿麻醉。E-mail: 934637173@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.004

R743.3

A

1002-266X(2015)12-0014-03

2014-11-30)