LMX1B基因突变检测对激素耐药型肾病综合征患儿的早期诊断价值

白丽春，覃远汉，黄韦芳，周志强，雷凤英，陈秀萍

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

LMX1B基因突变检测对激素耐药型肾病综合征患儿的早期诊断价值

白丽春，覃远汉，黄韦芳，周志强，雷凤英，陈秀萍

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 分析LMX1B基因突变检测对激素耐药型肾病综合征(SRNS)患儿的早期诊断价值。方法 正常儿童(对照组)、激素敏感型肾病综合征患儿(SSNS组)、SRNS患儿(SRNS组)各100例，采用PCR法扩增LMX1B基因第4、5、6外显子，以琼脂糖凝胶电泳鉴定产物后，进行单链构象多态性分析，对迁移率或条带异常者进行 DNA 测序，比较3组LMX1B基因突变情况。结果 第4、5、6外显子扩增产物符合LMX1B基因外显子片段进行纯化和测序标准。突变均位于第4外显子，第5、6外显子未发现明显突变。纯合错义突变c.745G>A(R246K)SRNS组5例，SSNS、对照组均0例，SRNS组与其他两组比较，P均<0.05；纯合错义突变c.731-733T>C、C>G、G>A(S242R)SRNS组23例、SSNS组9例、对照组2例，SRNS组与对照组比较，P<0.05；无义突变c.733-734insT(K243*)SRNS组9例、SSNS组17例、对照组0例，SRNS、SSNS组与对照组比较，P均<0.05；同义突变c.733G>C(S242S)SRNS组2例、SSNS组11例、对照组3例，P均>0.05。结论 LMX1B基因纯合错义突变c.745G>A可能是原发性肾病综合征患儿产生激素耐药的原因，检测该指标对SRNS患儿早期诊断具有一定价值。

肾病综合征；激素耐药；基因突变；LMX1B基因；儿童

原发性肾病综合征(PNS)是儿童时期常见的肾小球疾病，目前治疗上首选糖皮质激素。80%～90%的PNS患儿对激素敏感，称为激素敏感型肾病综合征(SSNS)；但仍有10%～20%的患儿对激素耐药，称为激素耐药型肾病综合征(SRNS)，超半数的SRNS患儿在10 a内进展为终末期肾病[1～3]。SRNS患儿治疗期间不仅激素使用剂量大、治疗时间长，而且易出现严重代谢紊乱，增加感染机会，增加治疗经济负担。研究发现，LMX1B基因突变可在甲髌综合征、SRNS和Alport综合征等疾病中出现并导致肾脏损害[4]。另有研究认为，LMX1B可调控NPHS2基因表达，引起nephrin缺失，间接导致肾病发生[5]。本研究通过检测SRNS患儿LMX1B基因突变情况，初步探讨LMX1B基因突变检测对SRNS患儿的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2010年1月～2013年2月广西医科大学第一附属医院收治SRNS患儿100例(SRNS组)，男81例、女19例，年龄1～13岁；SSNS患儿100例(SSNS组)，男78例、女22例，年龄8个月～14岁；体检健康且实验室检查正常者100例(对照组)，男50例、女50例，年龄2～14岁，均无肾病病史和肾病家族史。PNS、SRNS、SSNS诊断标准参照文献[6]。

1.2 方法

1.2.1 LMX1B基因外显子片段设计及检测 采用PCR方法。抽取研究对象外周静脉血2 mL，EDTAK2抗凝，3%明胶沉淀白细胞，用DNA分离试剂盒抽提基因组DNA。PCR体外扩增LMX1B基因第4、5、6外显子片段。设计LMX1B基因片段引物序列(见表1)，PCR扩增基因3个外显子及其周围部分内含子。PCR反应体系(50 μL)：基因组DNA 100 ng，5 pmol/L正、反向引物各1 μL，dNTPs 200 μmol/L，MgCl2115～315 mmol/L，Taq DNA聚合酶115 U。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、53～58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min(循环35次)，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物加入2%琼脂糖凝胶电泳槽，100 V电泳30 min，紫外灯下观察结果。

1.2.2 LMX1B基因突变单链构象多态性(SSCP)检测 取6.0 μL PCR产物加入9 μL上样缓冲液(含97%甲酰胺、20 mmol/L MEDTA、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青FF)混匀，98 ℃变性10 min，迅速置冰上3 min。取6.5 μL上述混合液上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，以1×TBE作为电泳缓冲液，220 V预电泳30 min，80 V电泳8～10 h。银染色后观察结果并摄影。SSCP分析出现单链DNA条带异常者，即与正常DNA的SSCP条带比较，样本DNA出现条带增多、减少或位置改变均视为有突变存在；PCR产物以正、反向引物为测序引物，应用ABI377测序仪进行DNA检测，采用NCBI Blast在线软件进行序列比对，当结果显示存在基因变异时，加测互补链以明确变异存在。从美国国立生物技术信息中心Nucleotide数据库资料中获取LMX1B基因序列(GeneBank: ID 4010，OMIM:602575)、mRNA 序列(NM_002316.3)和蛋白质序列(NP_002307.2)，根据人类DNA 序列变异命名建议命名突变基因。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LMX1B基因外显子片段扩增及检测结果 所设计的3对引物均有特异的扩增产物，与所设计扩增片段大小一致(164～252 bp)；扩增条带单一，符合LMX1B基因外显子片段纯化和测序标准。突变均位于第4外显子上，第5、6外显子未发现明显突变存在。

2.2 各组LMX1B基因第4外显子基因突变及多态性比较 见表1。

注：R246K为c.745G>A；S242R为c.731-738T>C、C>G；K243*为c.733-734；S242S为c.733G>C；与对照组比较，*P<0.05；与SSNS组比较，△P<0.05。

3 讨论

LMX1B基因位于常染色体9q34.1，由含有8个外显子约82 kb的DNA编码372个氨基酸的目标蛋白生成[7]，是一个具有LIM-同源区的转录因子，属于转录因子家族，富含半胱氨酸和锌结合区域，这一区域有助于该蛋白与其他转录因子相互作用[8]。LIM-A和LIM-B主要参与蛋白和蛋白的结合，而同源区域主要调节DNA的结合[9]。LMX1B转录因子同源区(第4～6外显子)在胚胎发育过程中发挥重要作用[7]，目前，认为该区域突变与肾脏疾病关系密切[10]。

本研究中5例SRNS患儿发现单杂合突变R246K，突变均位于LMX1B基因第4外显子，转录因子LIM-A、LIM-B区第246位(同源区223位)精氨酸变为赖氨酸，碱基位于c.745位点，G→A、AGA→AAA、精氨酸→赖氨酸。该突变未在SSNS组和对照组发现。近期研究发现，LMX1B基因同源区域与肾脏正常功能的维持关系密切，其最多见的突变位点为R198X、R200Q、R208X、A213P、R223X[7]，本研究结果与文献报道相似。Rohr等[4]研究发现，LMX1B基因敲除小鼠肾小球足细胞生成减少，Podocin和LMX1B共表达于足细胞；当LMX1B基因失活时，Podocin消失。Miner等[11]研究发现，LMX1B基因敲除小鼠其肾脏足细胞分化出现严重障碍，Podocin和CD2AP表达明显下调。LMX1B基因调节Col-Ⅳ和Podocin的合成，与甲髌综合征肾脏损害、Alport综合征和SRNS发病关系密切[4]。本研究结果也提示，LMX1B基因R246K突变的PNS患儿可能更容易产生激素耐药。

本研究发现，LMX1B基因纯合错义突变S242R，TCG→CGA、丝氨酸→精氨酸SRNS 组23例、SSNS组 9例、对照组2例，SRNS组与对照组间差异有统计学意义，但其余组间比较差异均无统计学意义；提示正常儿童如存在此突变，PNS发病率可能较一般儿童高，且更易对激素耐药，具体机制有待进一步研究。该结果目前尚未见相关文献报道。Dunston等[8]报道，LMX1B基因同源区位点c.725C>A、P.S242X可在甲髌综合征中出现，但具体机制等未进一步阐述。本研究中K243*，密码子由AAG转变为TAA，导致编码蛋白提前终止，为无义突变；其中SRNS组9例、SSNS组17例、对照组0例，SRNS、SSNS组与对照组比较P均<0.05。由此推测，该无义突变可能是引起PNS的原因之一，但该无义突变与激素敏感或耐药无明显相关性。该突变目前尚未见相关文献报道，引起PNS的机制有待进一步研究。本研究还发现，S242S密码子由 TCG转变为TCC，均编码丝氨酸，为同义突变；其中SSNS组11例、SRNS组2例、正常组3例，3组比较P均>0.05。该结果提示，同义突变编码的氨基酸相同，可能是基因多态性的一种表现。有学者认为基因多态性即使不引起氨基酸序列的改变，也可能通过该基因转录产物mRNA结构的变化或通过转录过程跳跃后引起基因失活，从而导致表型变化[12]。

综上所述，LMX1B基因纯合错义突变R246K(c.745G>A)可能是PNS患儿产生激素耐药的原因，检测该突变对SRNS早期诊断具有一定价值。

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Diagnostic value of LMX1B gene mutation detection in early diagnosis of children with steroid-resistant nephrotic syndrome

BAILi-chun,QINYuan-han,HUANGWei-fang,ZHOUZhi-qiang,LEIFeng-ying,CHENXiu-ping

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To discuss the diagnostic value of LMX1B gene mutation detection in the early diagnosis of children with steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS). Methods Normal children (control group), steroid sensitive nephrotic syndrome (SSNS) patients (SSNS group) and SRNS patients (SRNS group) were selected, every group contained 100 cases. We used the method of PCR-SSCP for the amplification of LMX1B gene in 4, 5, 6 exons. After using agarose gel electrophoresis to identify the products, single strand conformation polymorphism (SSCP) was used to analyze the PCR products. DNA sequencing was performed on the abnormal mobility or strips, and the mutation of LMX1B gene was compared between the 3 groups. Results The amplification products of exons 4, 5 and 6 complied with the purified and sequenced standards of LMX1B gene exon fragments. Mutations were located in the fourth exon, and no obvious mutations were found in the exons 5 and 6. Homozygous missense mutation c.745G>A (R246K), SRNS group had five cases, SSNS group and control group had zero case; LMX1B gene homozygous missense mutation c.745G>A in the three groups had statistical significance (allP<0.05); homozygous missense mutation c.731-733T>C, C>G, G>A, S242R, SRNS group had 23 cases, SSNS group had 9 cases, and the control group had 2 cases, significant difference was found between the SRNS group and the control group (allP<0.05); nonsense mutation c.733-734insT (K243*), the SRNS group had 9 cases, SSNS group had 17 cases, and none of the control group (allP<0.05); synonymous mutation c.733G>C (S242S), the SRNS group had 2 cases, the SSNS group had 11 cases, and the control group had 3 cases (allP>0.05). Conclusion LMX1B gene homozygous missense mutation c.745G>A may be the reason of the primary nephrotic syndrome in children with steroid-resistant, and it has some value in the early diagnosis of SRNS.

nephrotic syndrome; steroid-resistant; gene mutation; LMX1B gene; child

广西科学研究与技术开发计划课题项目(桂科攻1140003A-6)。

白丽春(1983-)，女，硕士研究生，主要研究方向为肾脏疾病。E-mail: bailichun0507@126.com

覃远汉(1964-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要研究方向为肾脏疾病。E-mail: qinyuanhan603@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.006

R725.7

A

1002-266X(2015)12-0021-03

2014-11-03)