研究新辅助化疗后口腔颌面-头颈鳞癌组织中Omi/HtrA2的表达及作用

耿乐乐 陈彦平

肿瘤的发生发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡有关，而后者的作用更为重要，化学药物和放疗杀死肿瘤细胞都是通过诱导细胞凋亡来完成的。促凋亡蛋白—Omi/HtrA2位于线粒体膜间隙，在凋亡诱导因子的作用下，Omi/HtrA2被释放到细胞液中，通过caspase途径和非 caspase依赖途径引起细胞凋亡［1，2］。本实验中，我们应用RT-PCR和免疫组化的方法检测经新辅助化疗药物——奈达铂干预的前后口腔颌面头颈鳞癌(鳞癌)组织和鳞癌癌旁组织中Omi/HtrA2表达的情况，判断奈达铂在其中的作用，以期为应用新辅助化疗提高口腔颌面头颈鳞癌控制率及生存率提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年3月至2013年8月于河北医科大学第四医院口腔科就诊患者45例，术前取病理已确诊为鳞状细胞癌(部分低分化鳞癌进行了免疫组化确诊)，其中高分化者36例，低分化者9例;45例鳞癌患者标本分鳞癌组(术前)、鳞癌组(术后)、鳞癌癌旁(距瘤缘2 cm)组(术前)、鳞癌癌旁组(术后)，以上4组标本均为术后即刻取材，分为两份，一份应用4%甲醛固定，另一份放于－80°低温冰箱编号保存。

1.2 实验试剂 Omi/HtrA2鼠抗人单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，Maxvision2/HRP免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，Omi/HtrA2及β-actin引物购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，RT-PCR试剂盒及1 500 bp DNAmarker购自美国Promega。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR检测mRNA表达变化:将标本组织匀浆后按Triizol试剂盒提供的操作步骤提取总RNA，－80℃保存。应用Promega公司的逆转录试剂盒合成cDNA，操作按试剂盒说明书进行。据GenBank中登录的Omi/HtrA2基因序列，设计引物。上游引物为5’-GACCGGCACCTTTCTTG-3’，下 游 引 物 为 5’-GCCCCCACTGGTTCATTT-3’;β-actin 内参上游引物为5’-CTGTTCCAGCCTTCCTTC-3’，下游引物为 5’-TCCTGCTTGCTAATCCAC-3’。每20微升反应体系包含cDNA 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl，Gen Green 10 μl。PCR 步骤:94℃ 预变性5 min，94℃变性 60 s ，52℃ 退火 60 s，72℃ 延伸60 s，共35个循环，72℃末次循环延伸7 min。扩增产物电泳，以β-actin基因作为扩增产物的参照，采用gel-proanalysis 3.1软件进行扫描观察结果，并记录结果。

1.3.2 免疫组织化学检测各组Omi/HtrA2的表达水平:标本经常规10%甲醛固定，石蜡包埋，将厚度定为4 μm，石蜡切片机连续切割各组石蜡包埋的组织，所得各组切片常规脱蜡。Maxvision2/HRP一步法行Omi/HtrA2免疫组化染色，Omi/HtrA2一抗的抗体浓度为1∶200，以PBS为阴性对照的一抗，已知阳性标本为阳性对照。

在光学显微镜下观察，胞浆中有棕黄色颗粒为Omi/HtrA2染色阳性。在一张切片中，随机观察5个高倍视野(×40)，数每100个细胞中阳性细胞的个数，计算平均值。①以阳性细胞百分比计分:＜5%为0分;5% ～25%为1分;26% ～50%为2分;51%-75%为3分;＞75%为4分。②以阳性细胞染色强度计分:未着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。①和②分值相加为总分，分级:0～1分为(－);2～3分为(+);4～5分为(++);6～7分为(+++)。低表达:(－)、(+)，高表达:(++)、(+++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用重复测量的方差分析，计数资料采用χ2检验和SNK两两比较法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mRNA表达 奈达铂干预前高分化鳞癌组、低分化鳞癌组、鳞癌癌旁组织组中Omi/HtrA2的灰度值依次递减，分别为 0.8126 ± 0.1249、0.4627 ± 0.1123、0.3761 ±0.1526，Omi/HtrA2mRNA 在三种组织中的表达量差异有统计学意义(P＜0.05)，SNK法两两比较表明，高分化鳞癌组中的表达高于低分化鳞癌组织、鳞癌癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。奈达铂干预后3组中Omi/HtrA2mRNA的灰度值分别为1.3553 ± 0.1614、0.6718 ±0.1421、0.4350 ± 0.1172，SNK法两两比较表明，高分化鳞癌组中的表达高于低分化鳞癌组织、鳞癌癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。比较 3组奈达铂干预前后 Omi/HtrA2mRNA的表达量，发现药物干预后 Omi/HtrA2mRNA的表达量高于药物干预前，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1，表1。

图1 Omi/HtrA2在不同组织中的mRNA表达情况

表1 Omi/HtrA2在不同组中mRNA的表达情况±s

表1 Omi/HtrA2在不同组中mRNA的表达情况±s

注:与高分化鳞癌比较，*P ＜0.05;与干预前比较，#P ＜0.05

组织样本 干预前灰度值 干预后灰度值高分化鳞癌(n=36) 0.8126 ±0.1249 1.3553 ±0.1614#低分化鳞癌(n=9) 0.4627 ±0.1123* 0.6718 ±0.1421*#癌旁组织(n=45) 0.3761 ±0.1526* 0.4350 ±0.1172*#

2.2 Omi/HtrA2蛋白的表达情况 在鳞癌组织细胞及鳞癌癌旁组织细胞中的免疫细胞化学染色均有阳性表达出现，DAB棕黄色颗粒着色在胞浆中。奈达铂干预前高分化鳞癌组、低分化鳞癌组、鳞癌癌旁组织组中Omi/HtrA2阳性表达率分别为 66.7%(24/36)、55.6%(5/9)、13.3%(6/45)，SNK 法两两比较表明，高分化鳞癌组中的表达高于低分化鳞癌组织、鳞癌癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。用药后3组Omi/HtrA2阳性表达率分别为 88.9%(32/36)、66.7%(6/9)、42.2%(19/45)，SNK 法两两比较表明，高分化鳞癌组中的表达高于低分化鳞癌组织、鳞癌癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。分别比较奈达铂干预前后3组间的差异，药物干预后各组中的表达情况大于药物干预前各组中的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 2，表 2。

图2 Omi/HtrA2蛋白在不同组中的表达情况(SP×400)

表2 Omi/HtrA2在不同组中的蛋白表达n=45，例

3 讨论

细胞凋亡参与了肿瘤的起始过程，并对肿瘤的发生起负调控作用。有研究发现，癌前病灶中细胞凋亡率比周围正常组织高出约8倍，提示由于转化后细胞分裂周期变短，机体需要通过细胞凋亡机制及时地加以清除。随着人们对Omi/HtrA2研究的逐步深入，其作为一种重要的具有蛋白酶活性的致凋亡分子，学者们对其在肿瘤发生发展中的作用也做了一定的探索，发现在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、喉癌、前列腺癌、胰腺癌和食管癌中均有 Omi/HtrA2高表达，推测 Omi/HtrA2与肿瘤发生发展有密切关系。此外，还有学者认为Omi/HtrA2可提高细胞对顺铂的敏感性，促进凋亡过程的发生［3］，亦有研究认为可以通过刺激Omi/HtrA2的活动从而导致细胞凋亡的发生［4］。

本实验结果显示经奈达铂干预后的各组中，尤其是高分化鳞癌组，Omi/HtrA2的表达较未经奈达铂干预的鳞癌组织中的表达明显增高，这与一些研究顺铂应用后增加细胞凋亡活动的结论相一致，推测Omi/HtrA2可增强细胞对化疗药物的敏感性。此外，鳞癌癌旁组及低分化鳞癌组经奈达铂处理后Omi/HtrA2表达亦有所增高，考虑奈达铂可诱导细胞凋亡的发生。而对于低分化鳞癌组中Omi/HtrA2为低表达或不表达，推测低分化鳞癌组织中通过对躲避致凋亡因子，使Omi/HtrA2沉默，并联合其他机制，从而减少其凋亡，形成其恶性程度高、侵袭性强、转移率高的能力。对于癌旁组织中Omi/HtrA2的高表达，推测组织病变发生到一定程度即可具有激活凋亡因子的能力，促使Omi/HtrA2的表达，这需要对收集更多类型及样本量的病变组织进行研究。

新辅助化疗的应用可使最终手术治疗和(或)放疗时的病变组织缩小，尽可能地减少器官的形态缺失和功能破坏，从而提高了病患的生存质量［5－7］。化疗药物在放疗过程中发挥了增敏剂的效用，二者结合使局部组织的治疗密度增加，并且对局部病灶的控制也有很好的效果，但有研究表明诱导化疗对病灶的远处转移有更好的治疗的效果［8－11］。根据本实验结果，我们推断以奈达铂为例的新辅助化疗药物可以增加鳞癌组织中的细胞凋亡过程，从而提高其对癌组织控制率，新辅助化疗对口腔颌面头颈鳞癌的干预有效，在分子水平上为诱导化疗治疗口腔颌面头颈鳞癌提供证据。

在肿瘤治疗中很多抗癌药物和放射疗法的目标是诱导肿瘤细胞发生凋亡，而肿瘤细胞凋亡信号通路的障碍是导致相关疗法效果不理想的重要原因，故欲提高化、放疗的效果需着眼于纠正肿瘤细胞凋亡机制的异常。肿瘤细胞对治疗的抵抗性与其凋亡程序的异常相关，能否成功地清除肿瘤细胞，在很大程度上依赖于治疗方法能否有效激活沉默的或被抑制了的凋亡途径。余丹等［4］经实验研究认为，通过干预Omi/HtrA2来阻断P53诱导凋亡中的Omi/HtrA2对XIAP的抑制作用，可达到抑制肝癌细胞的目的，为肝癌治疗提供了新的靶点。根据实验结果，我们推测如果在肿瘤组织中使Omi/HtrA2大量激活，进而增强机体对化疗药物的敏感性，促进细胞凋亡，缩小病灶组织，减少器官形态缺失以及功能破坏，可达到治疗肿瘤的目的;并且减少了化疗药物的剂量，从而减少不良反应的发生，提高患者的生活质量，为化疗药物治疗恶性肿瘤提供了新思路。

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