内质网应激与心肌缺血再灌注损伤

内质网应激与心肌缺血再灌注损伤

张国中, 刘增长

(重庆医科大学附属第二医院 心内科, 重庆, 400010)

关键词:内质网; 心肌缺血再灌注; 应激; 损伤

内质网(ER)是胞质参与蛋白质折叠、加工、分泌及调节Ca2+储存、转运的多功能细胞器。内外环境改变可导致ER功能错乱，使其未折叠蛋白聚集、钙稳态破坏，导致内质网应激(ERS)，它本身是一种自我保护机制，但过强或过久均会导致细胞死亡，从而对心肌缺血再灌注损伤(I/R)过程中多种反应起调节作用。本文就近年ERS在I/R中的研究进行综述，现报告如下。

1内质网应激

缺血缺氧等各种刺激因素作用于内质网均能导致其功能紊乱，从而引起内质网应激，它参与了缺血/再灌注病理变化进程中的多步反应, 在易患I/R的小鼠心肌细胞内可见ERS标志物的升高[1]。在初期，这种反应通过各种效应恢复内质网的功能，是一种代偿保护机制。

1.1　未折叠蛋白质反应(UPR)通路

未折叠蛋白质反应主要是可以抑制内质网中蛋白质的分泌、对蛋白质进行重新折叠以及对错误折叠蛋白的清除。其发生主要涉及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)/免疫球蛋白结合蛋白(BIP)及三种ERS感受蛋白：PERk、IRE1、ATF6。在体内外心肌缺血再灌注损伤模型中均可检测到GRP78、PERk及IRE1表达明显升高。GRP78是内质网应激反应的特异性蛋白，在UPR早期还可以修复蛋白的组成。PERK是一种跨膜伴侣蛋白，被激活后可磷酸化eIF2α, 从而抑制缺血期蛋白质的合成以及激活再灌注损伤中的细胞凋亡信号通路。eIF2α的磷酸化还可以通过促进ATF4的mRNA的转录从而编码大量UPR相关目的基因，引起一系列级联效应。IRE1是一种有内切核糖核酸酶的跨膜蛋白，ERS可触发其核糖核酸酶活性，从而控制与UPR相关的包括蛋白质折叠在内的基因编码蛋白质的转录、蛋白质的生成以及磷脂的分泌；ATF6是由ERS激活的一种膜结合转录因子，细胞处于ERS状态时被转运到高尔基体后被剪切而释放其胞质区碎片ATF6f，从而诱导UPR目的基因的表达[2]。Yao等[3]通过实验证明了ATF6还可以调节CHOP的表达。

1.2　其他通路

内质网过度负荷反应(EOR)是内质网应激的另一表现形式，由正确折叠的蛋白质在内质网内过度蓄积激活NF-kB而引起。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是肝内调节固醇代谢的重要蛋白，当ERS时内质网膜表面合成的胆固醇被耗竭可启动SREBP通路而调控脂代谢。实验证明在受损的心肌细胞中内质网应激标志物p-eIF2α和CHOP的上调伴随着明显的SREBP-1的激活[4]，并且参与I/R细胞凋亡途径的caspase-7的表达也受SREBP的调节。

2内质网应激在I/R过程中的促细胞凋亡作用

心肌缺血再灌注损伤过程中发生着包括心肌细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等多种细胞在内的凋亡，并且细胞凋亡数与心肌损伤程度呈正比。而内质网应激引起的细胞凋亡是不同于传统的线粒体凋亡及死亡受体凋亡的另一条新的凋亡途径，它并不直接引起细胞的凋亡，而是通过激活下游的凋亡因子，如CHOP/GADD153、ASK1/JNK、Caspases以及Bcl-2等。

2.1　激活Caspase-12通路

Caspase-12是介导ERS凋亡的关键分子，Caspase-12-/-的大鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可继续发生[5], 所以Caspase-12是ERS诱导凋亡的特异性蛋白酶，与I/R中ERS介导的细胞凋亡密切相关。正常情况下caspase-12与TRAF2结合形成稳定的复合物，不引起细胞凋亡，而ERS可激活caspase-12, 从而切割并激活caspase-9、caspase-3酶原等效应caspases并切割多ADP聚合酶和多种其他细胞内的底物，最终导致凋亡。阿托伐他汀可以通过降低ERS过程中caspases-12的表达，减少凋亡细胞的生成，改善再灌注后的心肌损伤、心梗面积以及左心收缩功能[6]。ERS还可以通过GHS-R1a/CaMKK/AMPK通路促进Caspase-12转录从而诱导凋亡[7], 磷酸化的TRAF2与IRE1结合也可以使TRAF2和caspase-12分离,激活caspase-12及细胞凋亡。

2.2　激活CHOP通路

CHOP是内质网应激诱导细胞凋亡的特异性转录因子，其基因启动子中含有ATF4、ATF6、XBP1等基因的结合位点，因此ERS时诱导产生UPR的三条通路均可引发CHOP的表达。非ERS情况下CHOP表达很低，当ERS诱导IRE1、ATF6活化后，其胞浆部分进入核内，启动CHOP的转录和表达，上调促凋亡基因Bax/Bak, 抑制抗凋亡蛋白Bcl-2, 进而诱导细胞凋亡[8]。实验证实CHOP的抑制剂能显著降低这种细胞凋亡过程，而其激活剂可以促进细胞凋亡。CHOP和caspase-12均促进了内质网应激中的级联反应的发生以及细胞凋亡作用的扩大，前者主要作用于再灌注损伤的早期，后者明显地激活了接下来再灌注损伤的扩大。

2.3　激活JNK通路

JNK是MAPKs家族中的一员，主要通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路参与到ERS引起的I/R的细胞凋亡过程中, JNK是内质网应激与缺血再灌注之间的重要的交叉通路，活化的JNK可以通过磷酸化调节Bcl-2家族蛋白介导细胞凋亡, JNK的抑制剂SP600125可以减少缺血再灌注损伤中ERS引起的CHOP以及caspase-12的表达从而减少细胞的凋亡[5]。此外，激活的IRE1与TRAF2、ASK1结合形成IRE1/TRAF2/ASK1复合物激活JNK和p38MAPK，进而激活CHOP途径诱导细胞凋亡[9]。

2.4　激活Bcl-2家族成员

Bcl-2家族按功能可分为两类：促凋亡分子主要有Bax和Bak两种，而Bcl-2/Bcl-xl能抑制细胞凋亡。当ERS激活CHOP和JNK激酶后均可削弱Bcl-2的抗凋亡作用，诱导内质网膜Bax和Bak的构象变化并寡聚化，最终导致膜完整性破坏、Ca2+外流，细胞质中Ca2+浓度升高诱发细胞凋亡。在体外实验中羌活皂甙C已被证明可以通过下调内质网应激及改变Bcl2/Bax的比例而减弱缺氧/复氧模型中心肌细胞的凋亡[10]。

3内质网应激在I/R过程中的促炎症作用

炎症反应参与了心肌缺血/再灌注损伤的全过程,其缺血损伤区有多种细胞因子表达及炎细胞浸润。内质网应激可以通过多种途径促进炎症反应的发生，从而参与到心肌缺血再灌注损伤的进程中。

3.1　NF-κB通路

核转录因子NF-κB是促炎症反应的中心调节因子，正常情况下, NF-κB与抑制因子IkB结合而呈非活性状态，炎性刺激时NF-κB暴露其核定位信号并转入到核内引起炎症相关的基因表达，产生TNF、IL-1、IL-6等炎性因子引起炎症反应。Wu等[11]通过实验证实NF-κB介导了内质网应激对I/R的损伤，并且其抑制剂可以减轻这种炎症反应。UPR的三条经典途径均可诱导I/R时NF-κB的激活：IKK通过受体蛋白TRAF2与IRE1形成复合物从而促使IκB磷酸化, NF-κB游离并转位于细胞核，进而启动炎症基因的转录[12]。在IRE1-/-细胞中，ERS诱导的NF-κB的激活和炎症因子TNF-α的产生明显减少，证明了IRE1能激活NF-κB。ERS激活PERK通路后, NF-κB入核增加。ERS时ATF6转运入高尔基体，裂解成有活性的氨基末端形式，转入核内导致Akt的磷酸化，激活NF-κB。用ATF6 siRNA处理可抑制Akt磷酸化可以影响NF-κB表达，从而抑制炎症反应[13], 改善心肌缺血再灌注损伤[14]。

3.2　其他途径

内质网应激还可以通过激活AP-1通路、炎症急性期反应等引起炎症反应的发生。IRE1/TRAF2/ASK1复合物及激活的JNK均可激活AP-1, 上调被AP-1转录因子复合物激活的炎症因子的表达，从而促进炎症的发生[15]。ERS时环磷腺苷cAMP应答元件结合蛋白H从内质网转运到高尔基体，被剪切后释放其氨基端进入胞质，与激活的ATF6形成二聚体并转运到核内，与编码急性期反应蛋白的基因启动子区域结合，参与调节急性期反应及炎症反应。ERS通过cAMP的表达增强了前列腺素E2、IFN-γ、IL-6的分泌，引发了机体的炎症反应[16]。用JNK1/2 siRNA处理后,内质网Ca2+的释放被完全阻断，说明Ca2+可通过JNK途径参与到ERS反应中[17]。调节PI3K-AKT通路也可抑制ERS，减少炎症因子的释放，证实了PI3K-AKT通路也参与了ERS的促炎症作用，并且AKT抑制剂处理后还可以降低ERS反应及其引起的炎症反应[18]。

4内质网应激在I/R过程中的促自噬作用

自噬是一种高度保守并且被精密调节的细胞活动，其主要是在受损的细胞器或者聚集的蛋白质表面会包裹双层质膜形成自噬体，并最终将其降解。内质网应激时腔内吡啶核苷酸的代谢紊乱会导致自噬的发生[19], 并且自噬小体LC3的形成依赖于IRE-1途径, IRE-1活化了TRAF2/JNK途径进而调控自噬。Bcl-2也参与了自噬、内质网应激等信号途径的调控，被认为是多条信号通路的交叉点，因此可以利用Bcl-2抑制剂通过干扰内质网应激-自噬之间的平衡而对心肌缺血再灌注起保护作用。

内质网应激还可以通过PI3K-AKT-mTOR通路介导细胞的自噬[20], 当细胞缺血缺氧导致NADPH缺乏时会被激活并通过使结节硬化症复合体2脱磷酸化引起内质网应激及自噬，同时抑制对自噬有潜在的抑制作用的mTOR。

在冠状动脉狭窄引起心肌缺血时可见LC3、beclin-1等自噬标志物的产生，在离体的大鼠心肌缺血再灌注模型中也可发现自噬的产生。但关于自噬在I/R过程中起的作用还存在很多争议，并且在缺血象和再灌注时象自噬起的作用也不同，有实验证明在心肌缺血前用适量的衣霉素或者毒胡萝卜素诱发产生的内质网应激导致的自噬可以减轻心肌缺血再灌注损伤的程度，减少了心梗面积及心肌细胞的凋亡，所以认为自噬在心肌细胞受损产生内质网应激及细胞凋亡过程中是起保护作用[21]; 但过量或过强的内质网应激引起的自噬则会导致心肌细胞的死亡。

5展望

综上所述, ERS引起的细胞凋亡、炎症反应、自噬等参与I/R发生发展的多个阶段，研究心肌缺血/再灌注损伤和ERS的关系能为心肌梗死等缺血性心肌病的研究提供重要理论基础，抑制内质网应激有望阻止心肌缺血后的病理过程，因此对ERS的减弱和抑制将会成为治疗心肌缺血再灌注损伤的一个新的治疗靶点[22], 也将为药物的发现提供新思路。早期及适当的内质网应激反应对机体抵抗疾病是一种代偿保护机制, Sylvain Grall等证实心肌缺血进行局灶缺血后处理也可通过上调内质网应激的标志物GRP78及活性AFT6而对心肌起保护作用[23], 因此将内质网应激控制在一定程度及范围内将是对机体对抗疾病具有保护作用，也是内质网应激研究的一个新的着手点，这种控制内质网应激在适量的程度的手法跟预处理[24]有异曲同工之妙。

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通信作者:刘增长

收稿日期:2014-12-20

中图分类号:R 542.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)07-170-03DOI: 10.7619/jcmp.201507058