克服单倍体相合造血干细胞移植免疫屏障的策略

何祎，韩明哲（中国医学科学院血液病医院血液学研究所移植中心，天津 300020）

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是恶性血液病的有效治疗手段，供者来源困难一直限制了此项技术的广泛应用。单倍体相合造血干细胞移植（haplo-HSCT）使3/6相合亲属移植成为可能，其中3/6相合亲属可来源于父母、同胞、堂兄妹、表亲之一，几乎能为100%的人群找到供者，有望从根本上解决供者来源问题。haplo-HSCT还具有易于取得干细胞以及今后有可能再次采集供者干细胞进行细胞治疗等优点，从而引起人们的广泛关注。同时由于供受者人类白细胞抗原（HLA）差异性增大，使得克服HLA免疫屏障的难度增加。本文就近年人们在克服haplo-HSCT免疫屏障方面采取的策略做一综述。

1 体外T细胞去除（TCD）的单倍体造血干细胞移植

1.1 体外广泛TCD：Perugia等［1］采用免疫磁珠分选CD34+细胞的方法进行移植物体外TCD。他们获得的移植物含有大剂量CD34+细胞（平均≥10×106/kg受者体重），并且CD3+细胞数量减少3～4个对数级。这一移植模式可以确保高植入率，尽管移植后不进行移植物抗宿主病（GVHD）的预防，GVHD的发生率也很低，但由于有助于移植后免疫重建的自然杀伤（NK）细胞、单核细胞以及树突状细胞（DCs）等也同时被去除，这种模式在移植后免疫重建缓慢，机会性感染（如病毒和真菌感染）的发生率增加，非复发病死率较高。Perugia小组［2］在现有模式的基础上进一步研究了移植后过继回输调节性T细胞（Tregs）对免疫重建的影响，并首次证实了通过过继回输Tregs能够促进淋巴细胞重建，并改进对机会性病原菌的免疫重建，而不减弱移植物抗白血病（GVL）效应。这一发现提示，为改善临床预后进行过继性输注基因修饰的T细胞和/或病原体特异性T细胞的必要性。

1.2 体外选择性TCD

1.2.1 选择性去除CD3+/CD19+细胞：上文提到广泛TCD模式移植后免疫重建延迟，有研究者提出采用移植物阴性选择去除CD3+/CD19+细胞，可以保留NK细胞、单核细胞以及DCs等。与未经处理的采集物移植相比，引起GVHD和B细胞淋巴增殖性疾病的发生率较低。最近一项研究显示，61例成人高危恶性血液病患者接受了减低剂量预处理和移植物去除CD3+/CD19+细胞的haplo-HSCT。55/61的患者获得植入，中性粒细胞数量大于0.5×109/L和血小板数量大于20×109/L的中位时间分别为12天和11天。Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的发生率分别为46%和18%。100天和2年的非复发病死率（NRM）分别为23%和42%。2年复发率为 31%，总生存率（OS）为 28%［3］。

1.2.2 选择性去除T细胞抗原受体（TCR）α、β+/CD19+细胞：γδT细胞是一群不引起GVHD但可能具有抗白血病作用的细胞［4］。有研究显示，41例进展期血液病患儿接受了haplo-HSCT，移植物通过使用CliniMACS （美天旎）的免疫磁珠分选系统去除了TCRα、β+/CD19+细胞。植入率为88%，Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD发生率分别为10%和15%。CD3+细胞＞ 100/μl、CD19+细胞＞ 200/μl以及CD56+细胞＞200/μl的中位时间分别为13、127和12.5天，显示免疫重建迅速［5］。

1.3 体外阻断共刺激途径诱导T细胞无能：T细胞活化的双信号模型显示T细胞必须接触抗原（第一信号）和共刺激信号（第二信号）才能有效活化，当仅有抗原刺激而缺乏共刺激信号时，将导致抗原特异性T细胞耐受［6］。研究最多的共刺激分子对是T细胞上CD28受体和抗原呈递细胞（APCs）上的B7-1（CD80）或B7-2（CD86）配体。细胞毒性T细胞抗原4（CTLA-4Ig）是一种重组融合蛋白，通过高亲和力结合B7分子，能够诱导T细胞耐受或无能，并防止B7分子和CD28的结合，有效阻断第二信号的传导。Guinan等［7］治疗了11例haplo-HSCT患者，在加入CTLA-4Ig的条件下，将供者骨髓（BM）与照射后的受者细胞共孵育，使得受者反应性辅助T细胞数量减少1～4个对数级，而不影响辅助T细胞对第三者异基因抗原刺激的反应性。临床结果显示，所有11例患者均获得植入，仅3例患者发生GVHD。

然而，上述所有体外TCD方法均治疗费用昂贵，细胞处理过程繁琐，需要有较高专业知识的人员指导参与，并非绝大多数移植中心均可广泛实施。

2 T细胞充足（TCP）的单倍体造血干细胞移植

2.1 移植后高剂量环磷酰胺（PT/Cy）：当在移植后狭窄的窗口期给予高剂量环磷酰胺（Cy），即移植后高剂量环磷酰胺（PT/Cy），能去除供者和宿主同种反应性T细胞，抑制GVHD以及移植物排斥。作为药物诱导免疫耐受的一种，PT/Cy策略利用的特性是增殖期同种反应性T细胞比静息期非同种反应性T细胞对DNA损伤剂的细胞毒性作用更为敏感。210例恶性血液病患者在约翰霍普金斯大学接受了减低强度预处理和半倍体骨髓移植（BMT）及高剂量PT/Cy，累积Ⅱ～Ⅳ度、Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的发生率分别为27%、 5%和13%，2年累积复发率和NRM分别为51%和15%，2年无事件生存（EFS）为34%；79例患者死于恶性病复发，相反，仅15例患者死于机会性感染，5 例死于 GVHD［8］。

Ciurea等［9］比较了 TCP联合 PT/Cy和 TCD两种移植模式进行haplo-HSCT的疗效，共65例患者入组，两组患者均接受相同的预处理即氟达拉滨〔40 mg /（m2·d）×4〕、马法兰（140 mg/m2）以及噻替派（10 mg/kg）。在TCP组和TCD组中植入率分别为94%和81%（P=0.1）。一年NRM在TCP组和TCD组分别为16%和42%（P=0.03）。在TCP组和TCD组，累积的Ⅱ～Ⅳ度aGVHD和cGVHD分别为27%对11%（P=0.5）和8%对18%（P=0.03）。在TCP组和TCD组，一年OS和无进展生存期 （PFS） 分别为66%对30% （P=0.02）和45%对21%（P=0.03）。TCP组改善的NRM和移植后良好的T细胞免疫重建相关。另一项研究显示，采用TCP联合PT/Cy模式的单倍体移植后免疫重建优于成人相合无关供者（MUD）或脐带血移植，甚至达到同胞全合供者（MSD）移植水平。针对人类巨细胞病毒（CMV）特异性T细胞的迅速恢复可以解释低的感染相关死亡，提示PT/Cy 模式保留了和重建感染免疫相关的静息期记忆T 细胞［10］。

Bashey等［11］比较了 PT/Cy模式 haplo-HSCT（减低强度27例、清髓18例）和同期进行的HLA相合亲缘供者（MRDs，n=115）及MUDs（n=99）移植的疗效。生存患者中位随访时间为36个月（范围9～74.5月）。36个月的OS在3种类型移植患者中没有显著性差异（在MRD、MUD和haplo-SCT分别为71%、58%和58%，P值无显著性差异）。36个月无病生存率（DFS）分别为47%、46%和55%，3组亦无显著差异。36个月预计的累积复发率在MRD、MUD和haplo-HSCT组分别为35%、38%和36%，差异亦无显著性。这些结果提示，haplo-SCT的疗效可以与MRD或MUD SCT相比。对于缺乏HLA相合供者的患者，部分不合同胞供者（PMRDs） 是一个可供选择的供者来源。

同时，我们也应注意到，PT/Cy模式尽管植入率高，GVHD以及NRM发生率低，但移植后复发率高仍是今后需要着重解决的难题。相信随着预处理方案的改进、移植后微小残留病的监测以及过继免疫治疗的开展，该模式的临床疗效会进一步提高。

2.2 供受者同时诱导免疫耐受的单倍体造血干细胞移植：国内黄等［12-15］采用供受者同时诱导免疫耐受的haplo-HSCT，即不进行体外移植物处理，通过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）体内诱导供者免疫耐受，强免疫抑制（主要是ATG）诱导受者免疫耐受等措施，可有效控制HLA不合所致的同种反应性。G-CSF体内应用后可使骨髓及外周血移植物内免疫细胞的构成发生改变，移植物内T细胞增殖能力下降，细胞因子分泌Th1极化为Th2，故有利于免疫耐受的形成。ATG的作用机制如下［16-18］：① ATG在血液和外周淋巴组织通过补体依赖溶解、T细胞激活和凋亡发挥体内TCD作用；② ATG调节关键的细胞表面分子，包括整合素 a4b7、VLA-4、CXCR4、CCR5和 CCR7，从而导致白细胞/内皮细胞相互作用；③ ATG诱导B细胞系和骨髓瘤细胞系的凋亡；④ ATG抑制髓系来源不成熟DCs的成熟，髓系来源不成熟DCs具有和耐受性DCs一致的表型；⑤ ATG诱导Treg和NK T细胞。Feng等［19］发现仅兔的ATG能够促进功能性Tregs体外扩增。逆转CD4+CD25-T细胞为Tregs，可以通过增强活化的T细胞核因子表达或诱导耐受性 DCs［20］。黄等［21］共报道 756例患者，3年预计的OS和无白血病生存率（LFS）分别为67%和63%。采用该方式因移植物中存在大量的T细胞可以促进免疫重建并预防复发，但同时急慢性GVHD发生率亦高于TCD模式，提示进一步改进GVHD预防的必要性。

总之，尽管近几年人们在克服haplo-HSCT免疫屏障方面取得了长足进步，尝试了多种克服单倍体移植HLA屏障的模式，但往往各有优缺点，到目前为止还没有一个公认的标准模式。创新的模式应向降低GVHD和植入失败（GR）发生率、迅速的免疫重建、增强抗白血病和抗病原体免疫反应以及改善移植预后等方向发展。