肝移植术后移植物抗宿主病诊治进展

杨靖波（天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室，天津 300192）

肝移植术后移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）比较罕见，发生率约为0.1%～2.0%，病死率大于75%。累及肝外多个系统，可侵犯包括周身皮肤、消化道黏膜、神经系统、骨髓等，临床表现不典型，多出现发热、皮疹、腹泻、癫痫、骨髓造血停滞等表现，但缺乏明确诊断的客观依据。

早在50多年前Billingham［1］就提出GVHD是供体T细胞与受体组织间的免疫反应。其发生需要以下条件：① 移植物中含免疫活性细胞；② 受体表达与供体不同的组织抗原；③ 受体对移植物的细胞缺乏免疫反应。

1 GVHD的发生机制

GVHD的发生相当复杂，危险因素包括人类白细胞抗原（HLA）匹配度、供受者年龄、患者免疫状态、移植前输血、再次肝移植、多器官联合移植等。其发生尤其与主要组织相容性抗原（majorhistocompatibilityantigen，MHA）的相合程度密切相关。可能的机制包括：① 相容性抗原的差异；② 供者免疫活性T淋巴细胞及自然杀伤细胞（NK细胞）；③ 细胞因子网络。

1.1 相容性抗原的差异：供受体间组织相容性抗原的差异是GVHD的始发因素。供者T淋巴细胞识别宿主不同的主要组织相容性复合物（MHC）抗原而增殖分化，并对含有该MHC抗原的某些受体组织或器官进行免疫攻击，发生GVHD。在HLA相合的移植中，次要组织相容性抗原的差异在GVHD的发生中起了重要作用［2］。

1.2 供者免疫活性T淋巴细胞及NK细胞：供者T细胞是GVHD发生的关键因素［3］。同种反应性细胞毒T细胞与分泌细胞因子的辅助T细胞可通过细胞毒反应和（或）释放淋巴因子参与GVHD的发生。Th1与Th2相互制约，机体通过调节Th1/Th2比例，维持细胞免疫和体液免疫的平衡。另外，有人发现,患者在移植前如果体内NK细胞活性正常或增高时，移植后则易发生GVHD。

1.3 细胞因子网络：GVHD被认为与Th1和Th2亚群所分泌的细胞因子失去平衡有关。目前大多数国外研究认为，肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1（IL-1）、IL-2及IL-6等在GVHD发生发展中发挥重要作用，其他细胞因子如IL-12、γ-干扰素（IFN-γ）、IL-18，Th2细胞因子如IL-4、IL-10、IL-13等也与GVHD的发生密切相关［4］。

肝移植术后GVHD根据不同的发病原因可分为两类：一类是血型ABO不相容所致的GVHD体液反应，其发生机制是供肝携带的淋巴细胞产生抗宿主红细胞抗体，导致受体发生溶血性贫血。这类过程常发生在移植手术后1～2周。这类疾病大多具有自愈性，个别严重贫血的患者可行输血治疗。另一类即文献中及临床上常描述的，供体T细胞所导致的细胞免疫性GVHD，其发生机制是供肝内的T细胞识别宿主MHC或次要组织相容性抗原而激活，随后发生克隆性分化和扩增。致敏T细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，形成细胞因子风暴（cytokinestorm），并进一步激活自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）及抗宿主细胞的毒性T 淋巴细胞（cytolytic T lymphocyte，CTL），进而导致一系列的正反馈连锁反应，最终作用于受者皮肤、消化道及骨髓等器官，引起严重的临床症状［5-6］。

近年来，Socié等［7］提出将GVHD发生的病理过程分为5个步骤：① 预处理导致组织损伤释放促炎性细胞因子，激活抗原呈递细胞及供者T细胞增殖；② 共刺激信号激活异源反应性T细胞；③异源反应性T细胞扩增与分化；④ 活化的异源反应性T细胞迁移到GVHD靶组织；⑤ 效应性T细胞破坏靶组织。

2 GVHD的诊断

Triulzi等［6-8］将肝移植术后GVHD的诊断标准归纳为以下三点：① 靶器官受累引起的特征性临床症状和体征，如皮肤、消化道、骨髓等；② 受累及的器官组织学检查；③ 受累及的器官或外周血中供体淋巴细胞存在的人类白细胞抗原（HLA）或DNA证据。到目前为止，肝移植术后GVHD的确诊仍是个挑战。受体外周血中出现供体细胞数量大于受者外周血有核细胞数量的1%时，再加上皮疹、发热、腹泻、全血细胞减少等临床表现，即高度提示肝移植术后GVHD。综合分析各种因素在疾病过程中的作用，将有助于提出新的特异性诊断指标，正确判断病情发展，及早采取有效的预防措施，也有助于指导临床GVHD的治疗，完善治疗方案。

2.1 以下是肝移植术后GVHD常见临床表现

2.1.1 GVHD相关皮肤、黏膜损伤：GVHD和中毒性表皮坏死松解症（TEN）均是肝移植术后少见而严重的并发症。严重的急性GVHD和TEN因临床表现相似，鉴别诊断比较困难，两者病理机制仍不明确。目前认为肝移植术后GVHD患者出现腹泻是由于细胞毒T细胞攻击胃肠道黏膜所致，免疫组化结果发现受者循环系统中存在淋巴细胞嵌合现象对诊断有重要作用［9］。皮肤活检可用于早期排查，如活检发现表皮基底层呈空泡样改变，苔藓样淋巴细胞浸润、角化不良、嗜酸粒细胞坏死等组织学特征，则高度提示GVHD，但特异性较差。若胃、十二指肠或结肠黏膜活检提示黏膜细胞凋亡并发现供者淋巴细胞浸润高度提示为GVHD。Jeanmonod等［10］报道1例肝移植术后病情急性进展的患者，肝移植术后10日，患者无明显诱因出现发热、皮疹、腹泻、骨髓造血停滞等，皮肤活检提示TEN，内镜见食道、胃黏膜多处糜烂，活检示非特异性炎症反应，免疫组化结果嵌合达40%以上，结合临床提示GVHD。激素冲击并广谱抗菌药物预防感染，皮疹消褪。患者最终因免疫功能低下合并严重感染，发病2周后死于感染性多器官功能衰竭。

1961年有学者发现，抗菌药物治疗异基因骨髓移植的嵌合体小鼠，可以明显降低小鼠的死亡率。一项在allo-BMT小鼠中所进行的研究发现，饲料中给予小鼠难吸收的抗菌药物，使小鼠成为无菌小鼠，可明显降低移植小鼠的死亡率。在无菌受鼠中，未发现任何移植小鼠死于GVHD，而在无抗菌药物饲养的对照组中，95%的小鼠移植后100天死于GVHD［11］。在一项以狗为对象的研究中也获得了类似的结果。在接受allo-BMT的实验狗中给予难吸收抗菌药物进行选择性肠道灭菌治疗，主要排除胃肠道中的需氧菌，而保留厌氧菌。由于肠道内源性菌群（主要为厌氧菌群）的存在，有效地抑制了外源性微生物在狗肠道中的繁殖，明显地降低了GVHD的发病率和发病程度［12］。

2.1.2 神经系统损害：越来越多的证据表明，GVHD也是移植术后发生神经系统并发症的危险因素。有报道显示，在GVHD模型鼠的脑组织中见到淋巴细胞浸润现象［13-14］。Hartrampf等［15］研究发现，在异基因造血干细胞移植GVHD鼠的中枢神经系统中检测到供者来源的活化T淋巴细胞浸润，以及受者神经细胞及胶质细胞死亡现象，研究中同时发现GVHD受者学习、记忆能力下降，焦虑行为表现增加。

2.1.3 骨髓造血停滞：GVHD能抑制骨髓造血，造成白细胞及血小板减少，甚至发生贫血、再生障碍性贫血。免疫组化分析可发现供受体嵌合现象，然而发生机制尚不明确。在GVHD发生早期，骨髓活检常提示一系血细胞（常首先为粒细胞系）减少，骨髓表现为轻微抑制。后期骨髓象示骨髓严重发育不良，各系血细胞减少，严重再生障碍性贫血表现。一旦出现这种情况，很难纠正，患者最终常因脓毒症或全身多器官功能衰竭而死亡。

2.2 关于嵌合的检测：1992年Starzl等［16］提出，肝、肾器官移植后长期生存的受者，其嵌合体不仅存在于移植器官，而且存在于全身。移植肝脏中约1×l09个细胞源于供者白细胞，包括单核细胞、T淋巴细胞、NK细胞，进入受者体内，目前已在受者多个器官，包括血液、淋巴结、皮肤、肠中发现，在长期存活的器官移植受者体内建立了稳定的嵌合状态。微嵌合体为受者全部有核细胞含供者细胞＜1%，微嵌合体理论认为供-受者微嵌合体是耐受的前提。系统性嵌合体（即受者全部有核细胞含供者细胞＞1%）在确定GVHD的受者中较普遍［17］。关于微嵌合体能否促进异体移植耐受性还存在争议。认为不能促进异体移植耐受的观点主要有：① 微嵌合体在器官移植耐受者中不普遍存在；② 微嵌合体是偶发现象，不能诱导耐受性。关于嵌合体的检测方法，目前常用的是聚合酶链反应（PCR），示例如下。

2.2.1 多聚合酶链反应-短串联重复序列（PCRSTR）：是一类高度多态性的遗传标志，由2～7个碱基对组成的核心序列经过几次到十几次重复，构成长度100～400 bp的特定DNA片段，又被称为“微卫星DNA”，是基因嵌合检测中非常敏感和特异的检测方法［18-21］，被大多数医院接受。PCR-STR可以快速检测受体内外周血中供体DNA，且不受供受体间HLA匹配影响，检测嵌合体时具有多态性高、结果稳定可靠等特点，其检测灵敏度可达1%。研究发现，肝移植术后出现GVHD特异性临床症状，且皮疹区组织活检行PCR-STR检测提示20%以上的供体CD3+T淋巴细胞，就可确诊GVHD。

2.2.2 PCR-SSP ：Taylor等［22］采用 PCR-SSP HLA分型筛选33例临床上怀疑为GVHD的患者，检查他们是否有供体细胞嵌合体的证据；其中7例患者检测到供体DNA，并经过流式细胞仪进行了确认。这7例患者中有5例在出现GVHD症状时行PCR。SSP检测到他们体内供体CD3+细胞的水平为20%～50%；另外2例患者在行肝移植4周后进行检测，结果分别为4%和8%。最终高嵌合表达的5例患者都死于肝移植后GVHD，另外2例也最终确诊为GVHD。Uchiyama等［23］借助HLA匹配度更高的活体肝移植分析HLA匹配是否对受体预后产生影响，以及HLA匹配与GVHD的关系。结果显示，HLA高匹配度不仅影响移植物远期预后，同时也是致命性GVHD的危险因素。

2.2.3 细胞因子检测：GVHD是由供者T细胞介导、通过细胞毒作用和分泌炎症细胞因子等机制导致组织损伤，可侵犯皮肤、胃肠道、肝脏、肺部等多种器官和组织［24］。很多研究机构开始将重点放在CD4+T细胞亚群及其效应因子免疫调控方面。其中包括Th17、IL-17、Th22、IL-22、Tr1及IL-10、IL-1、IL-18、IL-17A、趋化因子等。有研究提出Toll样受体也与GVHD有一定关系，他可能通过诱导抗原呈递、调控炎症细胞因子分泌或直接影响Th细胞功能等途径，影响GVHD的发生发展。

GVHD重在预防，首先是供体的选择，尽量避免使用HLA位点相近的供体；其次供肝处理过程中，尽量耗竭供体中的T细胞；然后对HLA配型相近或年龄较大的受者，术后应用比较温和的免疫抑制方案，但这也可能增加受体发生排斥反应的风险。目前GVHD确诊尚存在困难，治疗更是争论不断，包括免疫抑制剂的调整、激素的应用，甚至炎性细胞因子拮抗剂的应用均存在争议［25］。现在临床预防及治疗GVHD，主要是通过使用免疫抑制剂以及去除移植物中的T淋巴细胞，也有报道是通过利用免疫细胞的免疫调节作用，干预细胞因子达到预防与治疗GVHD的目的，但因为GVHD发生机制尚不明确，且免疫系统呈网络式表达与相互制约，GVHD免疫调节方面的预防与治疗仍处在初期阶段。曾有研究报道使用CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞预防GVHD，提高临床HIA半相合造血干细胞移植（HSCT）的成功率［26-28］，Bacchetta等［29］将体外诱导得到的同种异体抗原特异性Trl细胞作为HSCT的辅助治疗手段。该方法是在体外将供者T淋巴细胞与受者外周血单个核细胞（PBMC）与IL-10共培养，然后将诱导分化得到的T淋巴细胞输注到接受HLA半相合的HSCT患者体内。应用该方法诱导分化得到的T细胞中除了有大量同种异体抗原特异性Trl细胞，还包含了初始以及记忆性T细胞，所以与单纯接受移植治疗的患者比较，急性GVHD的程度较轻，而且未发生慢性GVHD。有研究发现，人的间充质干细胞（BMMSC）在体外具有免疫负调节作用［30］。Le Blanc等［31］的实验结果表明，BMMSC对混合淋巴细胞反应有显著的免疫调节作用。胡文兵等［32］实验发现，BMMSC在体内对不同的T细胞亚群表现出不同的调节作用。BMMSC联合移植组与单纯异基因骨髓移植组比较，CD4+细胞数量明显减少，CD8+细胞数量明显增多，说明BMMSC在体内能够减少CD4+细胞数量，同时增加CD8+细胞数量。

GVHD发生机制尚不明确，诊断困难，治疗往往延误，GVHD患者最终常因脓毒症等死亡，故应常规监测，尽早给予敏感抗菌药物及有针对性的支持治疗是有必要的。关于细胞因子在GVHD中的作用，目前的研究尚缺乏系统性，其潜在有效性尚需大量实验予以进一步证实与探索。