骨结构重建的细胞力学研究进展

霍波，白雪

北京理工大学宇航学院，北京 100081

骨结构重建的细胞力学研究进展

霍波，白雪

北京理工大学宇航学院，北京 100081

在19世纪末人们就已经认识到，骨骼所处的力学状态改变时，骨内结构就会发生相应的变化和调整，并形成优化的承力结构。如何解释这种力致骨重建现象的细胞-分子机制是目前骨细胞力学方向的主要研究任务。本文综述了力学刺激作用下骨组织细胞的生物学响应，并分析了其所处的不同力学微环境，即基质变形、振动、流体剪切力、压力和微损伤等，对骨组织结构重建的影响。

骨组织；骨质疏松；力学微环境；力学刺激；骨重建

人们在日常生活中已经注意到很多“废用导致骨吸收”的现象，例如长期卧床的患者会发生骨质流失，从而导致骨质疏松疾病；又如航天员因为长期处于微重力环境其体内某些部位的骨质会以每月2%的速度流失［1］。反之，体育锻炼或适当的运动则会增加骨质，例如网球运动员用于击球的手臂的骨质密度显著高于另一侧手臂。那么，运动和废用与骨结构的关系是什么呢？实际上，早在19世纪末，德国骨科医生Julius Wolff（1836-1902）就已经发现骨的结构可以顺应于力的传递方向而发生优化［2］，他的这一发现也被称为“Wolff定律”，至今仍是骨力学生物学领域的主要研究课题。

Wolff定律的重要性在于揭示了骨结构随力学环境发生顺应性改变的过程并非自然选择的后果，而是在生命体的发育和生长过程中发生的。成人体内的骨中既有骨形成也有骨吸收发生，这两个过程的动态平衡维持着骨骼的结构及其功能，如果其中任一过程受到抑制或过分活跃，都会引起骨骼的疾病。因此骨组织的结构重建最终是由其中的细胞来调控的，从而深入透彻地理解力致骨重建的细胞/分子水平的响应机制对于真正阐明Wolff定律具有至关重要的作用。

由于骨的微观结构的复杂性，因此骨内的细胞会受到非常复杂的力学作用。骨组织中的几种主要细胞都是贴壁细胞，基质的力学性质、拓扑形貌都会影响细胞与基质间的粘附性质，进而影响细胞的生物学行为。人体的运动是周期性的，从而不可避免地在细胞周围产生力学刺激的动态变化，进而会影响细胞的生物学响应。另外，由于骨的多孔性质，以及孔隙内液体的存在，在外力作用下不同位置处的液体压强会出现差异，从而引起液体的流动，并会在细胞表面造成流体剪切力。应该指出的是，骨的变形和液体流动还会对细胞施加压力作用。随着骨骼的生长或外载荷的作用，骨内会存在大量的微损伤，从而改变了细胞周围的基质结构，造成其力学环境的变化。下面具体介绍近年来骨细胞力学方向的相关研究进展，主要内容为分析骨组织细胞周围力学环境的几个主要状态，即基质变形、振动、流体剪切力、压力和损伤等，对骨组织结构重建的影响。

1 基质变形

骨组织中的几种细胞，如间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞等，都粘附于胞外基质中。当骨受到力学刺激时，最直接的响应是骨内基质的变形。这种变形会通过胞外基质传递到细胞，进而引起细胞膜及其内部结构的变形并进而引起生物学响应。由于通常人体所受的力学载荷是周期性变化的，因而传递到细胞周围的基质变形也应是动态的。

多项研究显示，应变刺激的应变峰值是影响成骨响应的主要因素。当改变应变峰值而维持其它参数不变时，新骨形成的量与应变峰值有密切相关性［3］。人体正常运动时骨基质发生的平均应变约在500 με-2500 με（1 με=10-6） 范围内，如果平均应变值超过0.7%（7000 με）时骨就会发生永久性的损伤［4］。生理状态下骨应变一般不会超过1000 με，但研究发现此应变水平并不能在骨细胞和成骨细胞上引起响应［5］，实际上并不能解释力学刺激引起细胞响应进而调控骨重建的假设。

由于上述提到的只是组织内的平均应变，人们开始怀疑在骨细胞周围的局部应变可能超过这个范围，例如，骨细胞突周围、骨陷窝内、骨重建单位内等处都会发生应变集中。2001年You等人建立了一个较为简单的模型，他们假设肌动蛋白纤维沿细胞突轴向排列，肌动蛋白纤维间由丝束蛋白连接，细胞突与骨小管壁面间通过与整合素相关的横向纤维单元连接［6］。You等人随后确实观察到了骨细胞突的超微结构［7］，在此基础上Han等人建立了一个更为精细的流体弹性动力学模型，研究了骨细胞突上流体导致应变放大的力学机制［8］。当骨所受的生理载荷为20 MPa时，按行走频率1 Hz计算，组织水平应变约为1000 με，此种情况下按Han等人的模型，细胞水平的应变是5000 με，从而足以引起细胞内的信号传导。

2 振动

1971年，Hert等人首次发现，骨重建由动态应变调控的，而静态应变并不能影响骨的重建［9］。近年来更为深入的研究表明，这种调控作用依赖于振动频率、加载间隔时间和加载率等参数。

频率 Turner等人的工作表明载荷频率和应变率是调控骨适应性变化的重要因素［10］。施加相同大小的应变刺激时，高应变频率会引起更为显著的适应性骨重建［11］。相似地，与1 Hz刺激相比，15 Hz至60 Hz的力学刺激可引进更高的骨生长［12］。每天施加10 min的力学刺激，当频率由1 Hz至60 Hz变化时，维持骨量所需的载荷大小有不同的阈值。实验中发现1 Hz刺激要求700 με纵向应变来维持现存骨量，而30 Hz则只要求400 με，60 Hz要求270 με。又如，对兔前肢施加10 Hz周期性载荷时，比1 Hz时的骨形成高10倍左右［13］。这些结果说明高频率振动刺激更在利于骨形成。

加载间隔时间 Rolbing等人将每天360次循环载荷分为两种加载组，一组中分4次，每次90次循环，另一组分6次，每次60次循环，结果发现都促进了骨形成效应［14］。需要指出的是，当增加力学加载的持续时间时，不但不会持续地增加骨量，反而骨形成响应会逐渐减弱，这可能是缘于细胞对力学刺激不再敏感了。但如果在加载周期之间增加一定的静止时间，则骨组织细胞又会再度响应力学刺激。Robling等人在每次循环间增加14 s的静止时间时，发现可以优化载荷引起的骨形成［15］。当他们在大鼠实验中对载荷周期间给予4小时的静止时间后，骨形成可增加1倍以上［16］。Lamothe和Zernicke的悬臂梁模型进一步证实这一结论，他们在施加总共时长为100 s频率为30Hz的循环载荷时，每隔1 s加入10 s的静止时间，这时总循环次数比不加静止时间降低了90%，但骨形成却增加72%［17］。以上研究结果说明，连续长时间加载并不利于骨形成，给予特定的间隔会帮助骨组织细胞再次获得对力学刺激的敏感性。

加载率 应变幅值的增加或减少的速率对于成骨潜能具有决定性的影响。一项较早的研究使用了非侵入式的加载装置，结果发现新骨形成量的变化主要依赖于应变率而非峰值应变的幅值［18］。另一项研究应用大鼠尺骨加载模型，施加了具有相同峰值应变和周期的动态载荷，但应变率由-0.018增加到-0.100 s-1，结果显示其可以促进骨形成［19］。Turner等人已经发现增加载率可显著促进成熟大鼠胫骨的骨形成［10］，同样新骨形成的量与应变加载率呈正相关性。此结论与人类运动学的研究结果类似，例如进行高水平冲击载荷训练的运动（如壁球、网球、三级跳等）比那些较平衡的运动（如游泳和骑脚踏车等）更有利于新骨的形成，并增加更多的骨量［20］。目前关于加载率如何影响骨组织细胞的响应，进而调控骨重建的相关研究仍较少，因此加载率影响骨形成的机制仍不清楚。

3 流体剪切力

Piekarski和Munro于1977年最早提出力学载荷在骨内引起液体流动，但那时他们只是认识到这种流动对于运送营养和带走代谢废物是非常必要的［21］。从20世纪90年代末开始，人们开始关注骨内孔隙中液体流动对骨内细胞的影响［22］。虽然理论模型已经用于预测骨陷窝-骨小管中的流体剪切力，但实验测定此种力的生理值仍较为困难。Wang等人发展了一种基于荧光漂白恢复的技术，可以利用激光共聚焦显微镜直接和实时地测量完整骨内的溶质的运动情况［23］。如果没有外载，则这种方法可以得到荧光染料的扩散系数，并确定胞外基质的孔隙尺度。2011年Price等人将荧光漂白恢复方法与计算模型相结合，预测得到了周期载荷作用下的液体流速为60 με，流体剪切力峰值约为5 Pa［24］。

20世纪90年代的一批研究成果证明了骨细胞对流体刺激的敏感性。Klein-Nulend等首次证明骨细胞对流体剪切力的敏感性［25］，而流体剪切力的水平与Weinbaum的预测结果相符［26］。越来越多的证据表明细胞外间隙液体的流动对于骨组织细胞的激活具有关键作用。Weinbaum等人假设作用于骨细胞突的流体剪切力是引起细胞响应的初始信号，并发展了一个精细的多尺度模型［26］。他们假设骨细胞突周围充满了胞外基质，这种基质可以让尺寸小于7 nm的分子通过，但会阻碍白蛋白等大分子。该理论预测，尽管骨的整体变形非常小，但由于胞外基质中空间尺度也较小（典型尺寸为100 nm），从而在骨细胞突的膜上产生的流体剪切力可达8至30 dyne/cm2，这与血管中内皮细胞周围的流体剪切力水平相似。

4 压力

骨组织细胞也会受到压力作用，但大小在骨陷窝-骨小管系统、髓内等不同位置会有差异［27］。在骨陷窝-骨小管孔隙中产生的静水压力，其大小是骨组织轴向应力的12%，但比血管通道内压力高近40倍［28］。当人们进行正常活动时，骨内静水压也是周期性变化的，振荡峰值从0至18 MPa，频率为1 Hz，并在骨陷窝-骨小管孔隙中产生0.27 MPa的流体压力。静水压通常会使细胞体产生比细胞突更大的变形［29］，也有人建立了多孔弹性细胞模型研究了单个细胞周围的局部变形［30］。

正常生理状态下的静水压约为138 kPa，但足以抑制破骨细胞在骨髓中的形成［31］，而303 kPa的压力可促进PGE2的产生，以及抑制成骨细胞中胶原的合成［32］。当对成骨细胞施加周期性静水压（0-68 kPa，1 Hz）或流体剪切力（1.2 Pa）时，可引起相似的ATP胞外释放和COX-2表达［33］。Klein-Nulend等对骨细胞、成骨细胞施加周期性流体剪切力和静水压力，发现骨细胞对流体剪切力特别敏感［34］，但也有人质疑此项研究中所用的静水压力13 kPa远小于在体情况下的5 MPa［35］。最近有人对MLO-Y4骨细胞施加68 kPa的周期性静水压力刺激，发现可以改变信号分子的传导［36］。近些年的研究结果显示，骨细胞更易感受骨内间隙液体的流动的刺激，而对流动电势和静水压则并不敏感。

5 损伤

实际上，人们的正常活动所引起的骨应变是非常小的，不足以直接引起骨破坏。但如同其它材料一样，长期的、周期性的力学载荷作用下，骨也会发生疲劳损伤，从而导致微观裂纹的形成。在体情况下骨内微损伤是由Frost首次发现的［37］，并被许多研究所证实［38］。骨内微损伤可刺激引起骨重建，即启动破骨细胞介导的骨吸收以及成骨细胞介导的骨形成过程［39］。在此过程中，首先破骨细胞向微损伤部位进行定向移动，以除去破坏的骨组织，随后成骨细胞会在此部位产生新的骨。如果损伤累积的速度高呈骨组织修复，则微损伤会发展为大的微裂纹，并扩展形成应力断裂。当骨废用或过度使用时，骨细胞的凋亡会促进骨重建部位数目的增加［40］，而引起骨细胞死亡的原因可能包括微裂纹对骨细胞造成的损伤或废用时骨细胞周围对流的缺乏。

6 总结与展望

由本文综述的近期研究结果可以看出，人们正在试图在动物和细胞水平的实验中区分不同力学刺激种类，即基质变形、振动、流体剪切力、压力和损伤等，并研究了这些因素对于骨重建的影响。目前该方向的研究进展已经获得了一些对临床防治骨骼疾病具有启发意义的结果。首先，人们已经通过实验和理论证明了骨细胞周围的力学刺激水平要远高于组织水平的平均应变，从而可以解释骨细胞参与力致骨重建的主要机制。进而，骨组织细胞会对振动刺激发生响应，并对频率、加载间隔时间和加载率更为敏感，但细胞如何进一步调控骨重建目前仍不清楚。流体剪切力对成骨系骨组织细胞的促进作用已经研究得较为彻底，但对破骨细胞的研究则较少。骨组织细胞对于压力的直接响应并不显著，当然由于相关研究更多集中于在体水平，仍需更多细胞水平的实验数据。已经证明骨内的微损伤可以介导定位骨重建，有理由相信损伤局部的某些化学物或力学微环境的梯度会参与破骨细胞的迁移和分化。

为了进一步明确骨组织细胞在不同力学刺激下对骨重建的贡献，仍需发展更为先进的细胞力学实验技术。虽然人们已经发展了很多对细胞进行力学刺激的实验装置，如用于模拟基质变形的基底拉伸装置、模拟振动刺激的细胞培养振动台、模拟流体剪切力的流动腔技术、静水压力装置等，但各个实验室所用的实验装置通常为自制，在细胞实际所受到的力学刺激参数上难以保证统一和准确。有些实验装置实际上是多种力学刺激的耦合，例如动态基底牵拉装置也会产生液体的流动，不同培养液面的高度会对细胞产生不同水平的静水压；又如流动腔通常只控制壁面流体剪切力，而不会区分静水压。因此在实际装置及力学刺激水平的精确控制上仍需要更为标准化和系统化的实验方法设计。

在骨重建的细胞力学领域，目前仍有大量未解决的问题，例如破骨前体细胞如何迁移到骨吸收区的前端？微缺损的存在是否影响破骨单体细胞的整合？细胞水平的力致钙响应在力致骨重建中扮演什么角色？显而易见，细胞水平的实验并不足以回答这些问题，需要开展在体研究。一个解决办法是继续发展在体3维荧光检测技术，通过荧光染料来标识骨组织细胞的位置和细胞内部的蛋白分子和细胞周围的溶质分子，这样才可在施加外载荷的同时观察复杂骨内结构中细胞的动态迁移和信号分子在骨内不同细胞间的传递。进一步结合基因转染等分子生物学技术并开展动物实验，就可以更为清晰地解释不同力学微环境下细胞中的分子信号转导通路，从而阐明Wolff定律的细胞/分子机制。

（References）

［1］ Lang T， LeBlanc A， Evans H， et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight［J］. J Bone Miner Res， 2004， 19（6）：1006-12.

［2］ Wolff J， Das Gaesetz der Transformation der Knochen［M］，1892.

［3］ Sugiyama T， Meakin L B， Browne W J， et al. Bones' adaptive response to mechanical loading is essentially linear between the low strains associated with disuse and the high strains associated with the lamellar/woven bone transition［J］. J Bone Miner Res， 2012， 27（8）：1784-93.

［4］ Fritton S P， McLeod K J， Rubin C T. Quantifying the strain history of bone： spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains［J］. J Biomech， 2000， 33（3）：317-25.

［5］ You J， Yellowley C E， Donahue H J， et al. Substrate deformation levels associated with routine physical activity are less stimulatory to bone cells relative to loading-induced oscillatory fluid flow［J］. J Biomech Eng，2000， 122（4）：387-93.

［6］ You L， Cowin S C， Schaffler M B， et al. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix［J］. J Biomech， 2001，34（11）：1375-86.

［7］ You L D， Weinbaum S， Cowin S C， et al. Ultrastructure of the osteocyte process and its pericellular matrix［J］. Anatomical Record Part a-Discoveries in Molecular Cellular and Evolutionary Biology， 2004， 278A（2）：505-513.

［8］ Han Y， Cowin S C， Schaffler M B， et al. Mechanotransduction and strain amplification in osteocyte cell processes［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004， 101（47）：16689-94.

［9］ Hert J， Liskova M， Landa J. Reaction of bone to mechanical stimuli. 1. Continuous and intermittent loading of tibia in rabbit［J］. Folia Morphol （Praha）， 1971， 19（3）：290-300.

［10］ Turner C H， Owan I， Takano Y. Mechanotransduction in bone： role of strain rate［J］. Am J Physiol， 1995，269（31）：438-42.

［11］ Richards M， Kozloff K M， Goulet J A， et al. Increased distraction rates influence precursor tissue composition without affecting bone regeneration［J］. J Bone Miner Res，2000， 15（5）：982-9.

［12］ Qin Y X， Rubin C T， McLeod K J. Nonlinear dependence of loading intensity and cycle number in the maintenance of bone mass and morphology［J］. J Orthop Res， 1998，16（4）：482-9.

［13］ Hsieh Y F， Turner C H. Effects of loading frequency on mechanically induced bone formation［J］. J Bone Miner Res， 2001， 16（5）：918-24.

［14］ Robling A G， Burr D B， Turner C H. Partitioning a daily mechanical stimulus into discrete loading bouts improves the osteogenic response to loading［J］. J Bone Miner Res，2000， 15（8）：1596-602.

［15］ Robling A G， Burr D B， Turner C H. Recovery periods restore mechanosensitivity to dynamically loaded bone［J］. J Exp Biol， 2001， 204（Pt 19）：3389-99.

［16］ Robling A G， Castillo A B， Turner C H. Biomechanicaland molecular regulation of bone remodeling［J］. Annu Rev Biomed Eng， 2006， 8：455-98.

［17］ LaMothe J M， Zernicke R F. Rest insertion combined with high-frequency loading enhances osteogenesis［J］. J Appl Physiol， 2004， 96（5）：1788-93.

［18］ O'Connor J A， Lanyon L E， MacFie H. The influence of strain rate on adaptive bone remodelling［J］. J Biomech，1982， 15（10）：767-81.

［19］ Mosley J R， Lanyon L E. Strain rate as a controlling influence on adaptive modeling in response to dynamic loading of the ulna in growing male rats［J］. Bone， 1998， 23（4）：313-8.

［20］ Deere K， Sayers A， Rittweger J， et al. Habitual levels of high， but not moderate or low， impact activity are positively related to hip BMD and geometry： results from a population-based study of adolescents［J］. J Bone Miner Res， 2012， 27（9）：1887-95.

［21］ Piekarski K， Munro M. Transport mechanism operating between blood supply and osteocytes in long bones［J］. Nature， 1977， 269（5623）：80-2.

［22］ Cowin S C. Bone poroelasticity［J］. J Biomech， 1999，32（3）：217-38.

［23］ Wang L， Wang Y， Han Y， et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2005， 102（33）：11911-6.

［24］ Price C， Zhou X， Li W， et al. Real-time measurement of solute transport within the lacunar-canalicular system of mechanically loaded bone： direct evidence for load-induced fluid flow［J］. J Bone Miner Res， 2011， 26（2）：277-85.

［25］ Klein-Nulend J， van der Plas A， Semeins C M， et al. Sensitivity of osteocytes to biomechanical stress in vitro［J］. FASEB J， 1995， 9（5）：441-5.

［26］ Weinbaum S， Cowin S C， Zeng Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses［J］. J Biomech， 1994， 27（3）：339-60.

［27］ Thompson W R， Rubin C T， Rubin J. Mechanical regulation of signaling pathways in bone［J］. Gene， 2012， 503（2）：179-93.

［28］ Chen J H， Liu C， You L， et al. Boning up on Wolff's Law：mechanical regulation of the cells that make and maintain bone［J］. J Biomech， 2010， 43（1）：108-18.

［29］ Docheva D， Padula D， Popov C， et al. Researching into the cellular shape， volume and elasticity of mesenchymal stem cells， osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy［J］. J Cell Mol Med， 2008， 12（2）：537-52.

［30］ Zhang D. Oscillatory pressurization of an animal cell as a poroelastic spherical body［J］. Ann Biomed Eng， 2005，33（9）：1249-69.

［31］ Rubin J， Biskobing D， Fan X， et al. Pressure regulates osteoclast formation and MCSF expression in marrow culture［J］. J Cell Physiol， 1997， 170（1）：81-7.

［32］ Ozawa H， Imamura K， Abe E， et al. Effect of a continuously applied compressive pressure on mouse osteoblast-like cells（MC3T3-E1） in vitro［J］. J Cell Physiol， 1990， 142（1）：177-85.

［33］ Gardinier J D， Majumdar S， Duncan R L， et al. Cyclic Hydraulic Pressure and Fluid Flow Differentially Modulate Cytoskeleton Re-Organization in MC3T3 Osteoblasts［J］. Cellular and Molecular Bioengineering， 2009， 2（1）：133-143.

［34］ Klein-Nulend J， van der Plas A， Semeins C M， et al. Sensitivity of osteocytes to biomechanical stress in vitro［J］. FASEB Journal， 1995， 9（5）：441-5.

［35］ Gardinier J D， Townend C W， Jen K P， et al. In situ permeability measurement of the mammalian lacunarcanalicular system［J］. Bone， 2010， 46（4）：1075-81.

［36］ Liu C， Zhao Y， Cheung W Y， et al. Effects of cyclic hydraulic pressure on osteocytes［J］. Bone， 2010， 46（5）：1449-56.

［37］ Frost H M. Presence of microscpoic cracks in vivo in bone［J］. Henry Ford Hosp. Med. Bull， 1930， 8：25-35.

［38］ Schaffler M B， Choi K， Milgrom C. Aging and matrix microdamage accumulation in human compact bone［J］. Bone， 1995， 17（6）：521-25.

［39］ Lee T C， Mohsin S， Taylor D， et al. Detecting microdamage in bone［J］. J Anat， 2003， 203（2）：161-72.

［40］ Noble B S， Peet N， Stevens H Y， et al. Mechanical loading： biphasic osteocyte survival and targeting of osteoclasts for bone destruction in rat cortical bone［J］. American Journal of Physiology-Cell Physiology， 2003，284（4）：C934-C943.

Advances in cell mechanics of bone remodeling

HUO Bo， BAI Xue
School of Aerospace Engineering， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081

Since the late 19th century it has been recognized that bone structure can be adapted to external mechanical loading. The mechanotransduction of bone cells is aiming to clarify the cellular and molecular mechanism of mechanically stimulated bone remodeling. This review summarizes the advances on the biological response of bone cells under mechanical stimulations， especially analyses the effect of different mechanical microenvironments on bone remodeling such as matrix deformation， vibration， fluid shear stress， pressure and microdamage.

bone tissue； osteoporosis； mechanical microenvironment； mechanical stimulation； bone remodeling

R35

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.15

2015-07-29；

2015-07-31

国家自然科学基金（11372043， 30970707）

霍波，教授，研究方向为骨质疏松及细胞力学，电子信箱：huobo@bit.edu.cn

引用格式：霍波，白雪.骨结构重建的细胞力学研究进展［J］.世界复合医学，2015，1（3）：272-276