皮肤墨水微生物限度检查方法的验证

陈飞 王晓青

皮肤墨水(skin marking ink)，又称划痕液，是《中国医院制剂规范》收载的品种，用于皮肤划线，示病灶范围，以便治疗［1］。现行标准中未收载微生物限度检查方法，且未见相关文献报道。该品种含有间苯二酚、苯酚、乙醇等成份、具有一定的抑菌能力。如采用常规法检查微生物限度，抑菌成分对检定有影响，可能显示假阴性结果。为有效控制制剂质量，本文根据《中国药典》(2010年版二部附录Ⅺ J)相关规定［2］，参考相关的研究［3］，对皮肤墨水的细菌、霉菌及酵母菌的细菌计数和控制菌检查方法进行了验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Mettler AE240型电子天平(美国梅特勒-托力多公司);LRH-250F型生化培养箱(上海一恒科技有限公司);LMO2012A511立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司);SW-CJ-IFD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］均由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 样品 皮肤墨水(长海医院1批，批号:130628;自制2 批，批号:131106，131111)。

1.4 培养基及稀释剂 胆盐乳糖培养基(批号:1211222)、改良马丁培养基(批号:1210232)、改良马丁琼脂培养基(批号:1110272)、营养琼脂培养基(批号:110310)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号:110224)、营养肉汤培养基(批号:120416)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:120416)、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基(批号:121124)，均为北京三药科技开发公司生产，灵敏度试验符合中国药典规定。pH值7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液(批号:120709)、0.9%氯化钠注射液(辰欣药业有限公司，批号:13041213602)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取经35℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤培养物，经25℃培养48 h的白色念珠菌改良马丁液体培养物，加入0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释至50～100 cfu/ml的菌悬液，备用。取经25℃培养1周的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，加入0.9%无菌氯化钠溶液适量，洗下霉菌孢子，采用管口带有薄无菌棉花的吸管吸出菌液，转移至另一无菌试管，标准比浊后用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释至孢子数约为50～100 cfu/ml的孢子悬液，备用。

2.2 供试液制备 取供试品10 ml，加pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，混匀，作为1∶10的供试液。

2.3 微生物计数方法验证

2.3.1 试验组:取供试液1 ml过滤，用pH值7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液700 ml分7次冲洗滤膜(每次100 ml)，在最后一次冲洗液中加入上述稀释的5种菌的菌悬液1 ml(50～100 cfu)，过滤，取出滤膜，贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基表面，分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h。

2.3.2 菌液组:取pH值7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，加入菌液 1 ml，过滤，取出滤膜，其余操作同“2.3.1”项下，测定所加入的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组:取供试液 1 ml，按“2.3.1”项下方法过滤冲洗，不加菌悬液，测定供试品本底菌落数。

2.3.4 稀释剂对照组:用相应的稀释液替代供试品，其余操作按“2.3.1”项下方法进行。

2.4 控制菌检查验证

2.4.1 试验组:取1∶10的供试液10 ml过滤，用 pH值7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液700 ml分7次冲洗，在最后一次冲洗液中分别加入10～100 cfu的金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌，取出滤膜，接入相应的100 ml营养肉汤培养基或胆盐乳糖培养基(BL)中，置30～35℃培养箱培养18～24 h，取上述培养物分别划线培养于甘露醇氯化钠琼脂培养基或溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，观察是否有典型菌落生长。

2.4.2 阴性菌对照组:取稀释液10 ml，以大肠埃希菌为对照菌株，按试验组方法操作，相同条件下培养。

2.5 计数方法验证结果 按方法项对3个批号的供试品微生物限度进行验证，试验结果见表1。结果表明采用薄膜过滤法检查皮肤墨水的细菌数、霉菌及酵母菌数，用700 ml冲洗液分7次冲洗，可消除供试品内抑菌成分的影响，试验组和稀释剂对照组的回收率均在70%以上，符合验证要求。

表1 微生物计数方法验证的回收率结果 n=3

2.6 控制菌检查验证结果 采用薄膜过滤法进行验证，阳性对照菌可检出，阴性对照菌未检出，按本薄膜过滤法进行控制菌检查方法可行。见表2、3。

表2 金黄色葡萄球菌检查验证结果

表3 铜绿假单胞菌检查验证结果

2.7 样品测定 根据上述试验结果，采用薄膜过滤法对三批样品进行细菌、霉菌和酵母菌计数和控制菌的检查，该方法可用于皮肤墨水的微生物限度检查。见表4。

表4 3个批号样品微生物限度检验结果

3 讨论

皮肤墨水中含有的间苯二酚、苯酚，具有较强的消毒防腐作用，溶媒也有一定比例的乙醇，采用常规法进行细菌计数的检查时，样品对细菌、霉菌、酵母菌均有一定的抑制作用，微生物计数方法的回收率结果不能符合要求。薄膜过滤法是消除药品中抗菌活性的最有效方法［4］，因此本文采用该方法用于皮肤墨水的微生物检查。对冲洗液用量的考察结果表明，需要较大量的冲洗液来消除处方中抑菌成分的影响，但是过大的冲洗液会损伤薄膜，导致回收率不合格，故最终选取了700 ml的冲洗液分7次冲洗来消除抑菌成分的影响。

微生物限度检查是药品质量标准中重要的一项内容，越来越受到重视。我国药典目前是按剂型规定了微生物限度标准，《中国医院制剂规范》亦采用剂型分类方法规定微生物限度标准。但医院制剂各生产单位的检验条件参差不齐，在实际操作中，各自建立微生物限度检查方法并进行方法验证较为困难。因此，有必要对不同单位生产的同一制剂品种制订统一的检验方法，这将有助于提高医院制剂整体的生产和检验水平。

1 中华人民共和国卫生部药政局主编.中国医院制剂规范.中国医药科技出版社，1995.17.

2 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典(二部).中国医药科技出版社，2010.附录 XI J 107-116.

3 孙玫，郭莲荣，季娇.乳核内消胶囊微生物限度检查方法验证.实用药物与临床，2010，13:200-202.

4 光新兰，张洪，戴鹏飞.薄膜过滤法在药品检验中的应用.医药导报，2006，25:253-254.