冰片对反式白藜芦醇药动学的影响研究

陈靓，王明凤，关艳，王俊俊，陈勇

（湖北省中药生物技术重点实验室（湖北大学），湖北省生物资源绿色转化协同创新中心（湖北大学），湖北武汉430062）

0 引言

冰片（borneol）又名片脑、龙脑、桔片、艾片等，是著名的中药“药引”，有通诸窍，散郁火，去翳明目，消肿止痛，清热散毒，散火解毒之功效［1］.2010年版的中国药典中收录含有冰片的成药有20余种，如安宫牛黄丸、复方丹参滴丸、牛黄降压丸等.近年来有许多文献报道冰片能明显松弛细胞间紧密连接，抑制细胞膜P-糖蛋白（P-gp）功能，促进其他药物进入各种生物脂质膜，提高其生物利用度［2-5］.

白藜芦醇（resveratrol，Res）是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，化学名称为3，4'，5－三羟基二苯乙烯，它有顺式与反式两种构型，后者是白藜芦醇的稳定结构.白藜芦醇主要来源于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物，具有广泛的生物学活性，能够抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、保护心血管、预防肝损伤，对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症也有预防作用［6-8］.但反式白藜芦醇口服生物利用度低，且体内代谢消除迅速［9-14］.本文中研究了冰片对反式白藜芦醇的药代动力学影响.

1 材料

1.1 实验动物 Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠（体重（280±20）g，购于湖北省实验动物研究中心）饲养于SPF动物房，自由饮水和饮食.

1.2 实验仪器 日本岛津高效液相色谱仪（包括LC－20AD二元泵、SPD－20A紫外检测器、CTO－20AC柱温箱、SIL－20ACHT自动进样器、LC－Solution工作站）；德国Eppendorf 5810R型高速离心机；德国Sartorius BP211D型电子天平；上海沪西分析仪器厂WH－2微型漩涡混合仪；天津仪器厂Vortex－5型漩涡震荡器；谭氏真空设备有限公司2XZ－4型旋片式真空泵；韩国BioTron Ecospin 3180C LABCONCO型真空浓缩离心机.

1.3 药品和试剂 反式白藜芦醇（纯度≥98%，批号111535－200502，中国药品生物制品检定所）；根皮素（纯度≥98%，20 mg，成都曼斯特生物科技有限公司）；冰片（纯度≥97%，50 g，阿法埃莎天津化学有限公司）；羧甲基纤维素钠（中国医药上海化学试剂公司）；分析纯Tween80（BIOSHARP公司）；分析纯乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水；色谱纯甲醇和乙腈（TEDIA公司）.

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex ODS（150×4.60 mm，5 μm）和预柱Zorbax C18 guard column（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（体积比，28∶72）；柱温：40℃；紫外检测波长：306 nm；流速：1.0 mL/ min；进样量：60 μL；分析时间为每个样品15 min.

2.2 对照品溶液配制 精密称量反式白藜芦醇对照品6.40 mg定容于5.0 mL容量瓶中（母液浓度为1.28 mg/mL），并配制标准品相应系列的浓度及质控浓度，于－20℃避光保存.精密称量根皮素对照品3.20 mg，甲醇溶解定容于5.0 mL容量瓶中（母液浓度为0.64 mg/mL），以甲醇稀释得浓度为6.4 μg/mL的根皮素溶液作为内标溶液，于－20℃保存备用.

2.3 血浆样品处理方法 取血浆100 μL置于1.5 mL EP管中，精密加入6.4 μg/mL的内标液8 μL，再加入乙酸乙酯250 mL，涡旋振荡混合3 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清200 μL至另一支1.5 mL EP管中，冷冻挥干后用100 μL流动相复溶，涡旋振荡混合3 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清80 μL进行分析.

2.4 动物实验 雄性SD大鼠40只，随机均分为灌胃给药和尾静脉注射给药两大组.灌胃给药包括反式白藜芦醇（30 mg/kg）单用组，以及反式白藜芦醇分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用组，每组5只.尾静脉注射给药包括反式白藜芦醇（10 mg/kg）单用组，以及反式白藜芦醇分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用组，每组5只.给药前禁食12 h但不禁水.灌胃给药组反式白藜芦醇和冰片用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液，于给药后2，5，10，15，30，60，120，180，240，360，480 min眼眶取血；尾静脉注射组冰片用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液，反式白藜芦醇用4% Tween80超声助溶，合用组冰片灌胃25 min后，尾静脉注射反式白藜芦醇，于给药后5，10，20，30，60，120，240，360，480 min眼眶取血.每只大鼠每次取血约0.5 mL，肝素抗凝，4℃、4 000 r/min离心10 min，取上清血浆100 μL，-20℃冻存备用.

2.5 数据处理方法 应用DAS3.0药动学分析软件（中国数学药理学学会），采用非房室模型处理血浆浓度-时间曲线，获得药动学参数.应用配对t检验进行给药前后生化指标的统计学分析，P＜0.05被认为有显著性差异.所有测试数据均采用平均值±标准偏差（M±SD）表示.

3 结果

3.1 方法专属性 取SD大鼠空白血浆100 μL，按“血浆样品处理方法”操作；将一定浓度的反式白藜芦醇标准溶液加入空白血浆中，配制成100 μL的含药血浆，同法操作；取给药后的SD大鼠血浆样品100 μL，同法操作.各血浆样品经HPLC分析见图1.结果表明空白血浆中内源性物质不干扰反式白藜芦醇（峰1）和内标根皮素（峰2）的含量测定，且反式白藜芦醇和内标分离良好.

3.2 标准曲线的制备 精密量取反式白藜芦醇对照品储备液，以甲醇和空白血浆稀释成反式白藜芦醇浓度为20，40，80，160，320，640，1 280 ng/mL的含药血浆，按“血浆样品处理方法”操作，进行HPLC分析.以反式白藜芦醇色谱峰面积与内标色谱峰面积之比（Y）为纵坐标，反式白藜芦醇浓度（X）为横坐标制备工作曲线.

回归方程为：Y＝0.006 569 66X＋0.248 543，r2＝0.999 3；线性范围为：20～1 280 ng/mL.

3.3 精密度与回收率考察 制备低、中、高浓度（40，160和640 ng/mL）反式白藜芦醇质控血浆样本各6份，并按“血浆样品处理方法”操作，在同一色谱条件下测定待测物和内标峰面积，代入标准曲线求得实测浓度，考核分析方法的日内、日间（连续3 d）精密度及回收率，结果见表1.

配制上述低、中、高3种浓度质控血浆样本各6份，并按“血浆样品处理方法”操作，在同一色谱条件下测定待测物和内标峰面积，代入标准曲线求得实测浓度，考察方法回收率.结果见表1.

图1 SD大鼠血浆中反式白藜芦醇及内标根皮素的色谱分离图

表1 反式白藜芦醇测定方法精密度与回收率（n=6，M±SD）

3.4 稳定性考察 配制成低、高两种不同浓度的血浆样本各3份，置于－20℃冰箱中冷冻保存10 d后取出，室温融解化冻，按“血浆样品处理方法”操作考察长期冷冻稳定性.配制成低、高两种不同浓度的血浆样本各3份，反复冻融3次后，按“血浆样品处理方法”操作考察反复冻融稳定性.配制成低、高2种不同浓度的血浆样本各3份，于室温放置7 h后按“血浆样品处理方法”操作考察样品室温放置稳定性.结果见表2.

表2 反式白藜芦醇稳定性试验（n=3，M±SD）

3.5 药物代谢动力学结果 大鼠灌胃反式白藜芦醇（30 mg/kg）及其分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用后的药代动力学参数见表3，反式白藜芦醇血药浓度-时间曲线见图2.结果表明，与反式白藜芦醇给药组相比，与高剂量冰片合用组浓度－时间曲线下面积（AUC）、血药峰浓度（Cmax）、平均驻留时间（MRT）、消除半衰期（t1/2）、表观分布容积（Vz）及达峰时间（Tmax）明显增大，但与低剂量冰片合用组上述指标（除Vz、Tmax外）均明显减小.此外，随冰片剂量增大，药物清除率（CLz）逐渐减小，其中与低剂量冰片合用时明显高于对照组，与高剂量冰片合用时明显低于对照组.

图2 反式白藜芦醇（30 mg/kg）及其分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用灌胃给药后大鼠血浆药-时曲线（n=5，M±SD）

表3 反式白藜芦醇单用及与冰片合用灌胃给药的药动学参数（n=5，M±SD）

大鼠尾静脉注射反式白藜芦醇（10 mg/kg）及其分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用后的药代动力学参数见表4，反式白藜芦醇血药浓度-时间曲线见图3.结果表明，与反式白藜芦醇给药组相比，合用组浓度－时间曲线下面积（AUC）、血药峰浓度（Cmax）、平均驻留时间（MRT）逐渐增大，表观分布容积（Vz）和药物清除率（CLz）逐渐减小.其中与高剂量冰片合用组AUC0～∞增大了73.6%（P＜0.05），Vz减小了39.2%（P＞0.05），Cmax升高了20.1%（P＞0.05），MRT0～∞延长了20.1%（P＞0.05），CLz减小了42.1%（P＜0.05）.

4 讨论

近年来研究表明，冰片能够促进药物吸收，提高血管壁通透性，开放血脑屏障及血－脑脊液屏障，从而提高药物的治疗效果［15-17］.在实验中，设定的反式白藜芦醇及冰片的低、中、高给药剂量均是参考中国药典（2010版）［18］中关于人的相关规定，经人与大鼠的给药剂量换算得出的.

本研究表明，反式白藜芦醇与冰片合用，不管是灌胃给药，还是静脉注射给药，对反式白藜芦醇大鼠体内药动学均有明显影响.与高剂量冰片合用，大鼠灌胃与尾静脉注射给药均能较明显提高反式白藜芦醇的AUC，延长MRT，降低CLz.在灌胃给药时，低剂量冰片降低了反式白藜芦醇在大鼠体内的AUC与MRT，提高了CLz；但高剂量冰片增加了反式白藜芦醇在大鼠体内的AUC与MRT，降低了CLz；这可能是冰片在低剂量时，对相关CYP450酶活的诱导作用［19-20］强于其对反式白藜芦醇的促吸收作用，而随着冰片剂量的增大，促吸收作用逐渐占据主导地位的结果.在静脉注射给药中，冰片对反式白藜芦醇的吸收虽有促进作用，但并不呈现剂量依赖性，说明冰片对药物影响的剂量效应并不明确，增加冰片的量不一定能成比例地促进药物的吸收，此结论对比相关研究，也可以得到佐证［21-22］.

大鼠与高剂量冰片合用能增加反式白藜芦醇的药-时曲线下面积，但冰片可能对反式白藜芦醇在大鼠体内的吸收、分布以及消除均有影响.但具体是哪条途径决定了冰片对反式白藜芦醇的药代动力学影响，还需要进一步的实验来验证.

图3 反式白藜芦醇（10 mg/kg）及其分别与低、中、高剂量冰片（50，100和200 mg/kg）合用静注后大鼠血浆的药-时曲线（n=5，M±SD）

表4 尾静脉注射反式白藜芦醇及其与冰片合用时的药动学参数（n=5，M±SD）

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