在Huh7细胞中原儿茶酸对肝细胞核因子（3α/3β/4α）的影响

吴逍，代小青，陈勇，韩凤梅

（湖北大学生命科学学院，湖北省中药生物技术重点实验室，湖北 武汉 430062）

0 引言

肝细胞核因子（Hepatocyte nuclear factor，HNF）是调节肝脏内基因特异性表达的转录因子，在肝脏中表达较多，它们大都含有保守的DNA结合区，通过结合在靶基因的调控区进而影响靶基因的表达［1］，在肝脏的发育、肝细胞的分化与功能维持中起着重要的作用.其中HNF1、HNF3、HNF4等都属于肝细胞核因子［2］，这些因子及其相互之间的作用构成了非常复杂的调控网络，它们通过在转录水平上有效地调节下游基因的表达，在肝脏的发育与功能维持中扮演着重要的角色.

原儿茶酸（Protocatechuic acid，PA）结构如图1所示，存在于很多常用的中草药中［3］，具有较多药理作用，如降低心肌的耗氧量、提高心肌耐氧能力［4］，抑制HepG2.215细胞中乙肝病毒抗原的分泌和DNA的复制［5］，对由鸭乙肝病毒引起的雏鸭肝损伤有一定的缓解作用［6］.

图1 原儿茶酸结构图

本研究的目的在于探究PA对几种HNF的影响，包括HNF3α、HNF3β、HNF4α.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Huh7细胞系（武汉大学细胞保存中心馈赠）；DMEM培养基与胎牛血清购自Gibco公司；二甲亚砜（DMSO）与噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；Trizol购自Ambion公司；β-actin，HNF3α，HNF3β和HNF4α的引物（β-actin，Forward:5’-TCACCCACACTGTGCCCATVCGA-3’，Reverse:5’CAGCGGAACCG CTCATTGCCAATGG-3’；HNF3α，Forward:5’-GTGGGTCCAGGATGTTAGGA-3’，Reverse:5’-CCGCAGTC ATGCTGTTCAT-3’；HNF3β，Forward:5’-CACCACCACCAACCCCACAAA-3’，Reverse:5’-TGCAACACCG TCTCCCCAAAG-3’；HNF4α，Forward:5’-GCAGGCTCAAGAAATGCTTC-3’，Reverse:5’-AGTGCCGAGGG ACAATGTAG-3’）购自上海桑尼生物科技有限公司；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；β-actin和HNF4α抗体购自Santa Cruz公司；抗大鼠和抗羊的二抗购自江苏碧云天生物技术研究所.

1.2 主要仪器 Hear Cell CO2培养箱（Heraeus公司）；XDS-1B倒置相差显微镜（佳源兴业科技有限公司）；iMARKTM酶标仪，CFX ConnectTM Real-Time System和My CyclerTM Thermal Cycler均购自于Bio-Rad公司；5415R台式低温高速离心机（Eppendorf公司）；DYY-6C型电泳仪/电泳槽和DYC-40 A型垂直电泳槽/电转仪均购于自北京市六一仪器厂.

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 Huh7细胞接种在含完全DMEM培养基的一次性培养瓶中，置于细胞培养箱（37℃、5%CO2）培养，在细胞汇合度达到90%左右后，消化传代细胞.

1.3.2 PA对Huh7细胞增殖的影响 用不同浓度的PA或者空白对照分别处理细胞24 h或48 h后，按MTT法检测PA对Huh7细胞增殖的影响.

1.3.3 PA对HNF（3α/3β/4α）mRNA水平的影响 提取细胞中的RNA，再将其逆转录为cDNA，然后按照荧光定量PCR试剂盒中的步骤操作.

1.3.4 PA对HNF4α蛋白水平的影响 提取细胞中的蛋白，然后进行蛋白印迹实验，探究PA对HNF4α蛋白水平的影响.

1.3.5 统计分析 实验数据均来自3次及以上的独立实验，数据以平均数±标准差来表示，统计学分析方法采用Student's t检验（其中*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）.

2 结果

2.1 PA对Huh7细胞增殖的影响 如图2所示，24 h和48 h的MTT结果显示，在PA浓度低于20 μg/mL时其对Huh7细胞的增殖没有明显的抑制作用，根据本次实验的结果我们选取了0.1，1，10 μg/mL三个PA浓度组进行后续的实验.

2.2 PA对HNF（3α/3β/4α）mRNA水平的影响 如图3所示荧光定量PCR结果显示，PA能够抑制Huh7细胞中HNF（3α/3β/4α）mRNA水平.

2.3 PA对Huh7细胞中HNF4α蛋白水平的影响 如图4所示PA能够抑制HNF4α的蛋白水平，在PA浓度为10 μg/mL时抑制效果最强.

图2 原儿茶酸对Huh7细胞增殖的影响

3 讨论

肝细胞核因子3有HNF3α、HNF3β和HNF3γ三种亚型，它们通过结合到肝细胞的特殊调控区的相似序列上，调节肝脏中基因的表达［7］，同时它们还能调节碳水化合物的代谢和脂肪的β氧化［8］.肝细胞核因子4有HNF4α、HNF4β和HNF4γ三种亚型［9］，HNF4α能与肝脏中其他的转录因子如HNF1、HNF6等相互作用，构成复杂的调控网络，调控肝脏的发育和分化［10-12］；HNF4α还是肝脏中碳水化合物、脂质、胆固醇、氨基酸和胆汁酸内稳态调节的关键因子［13］.

图3 原儿茶酸对Huh7细胞中肝细胞核因子（3α/3β/4α）mRNA水平的影响

图4 原儿茶酸对Huh7细胞中肝细胞核因子4α蛋白水平的影响

本论文研究表明，在Huh7细胞中，PA既能够抑制HNF3α/HNF3β/HNF4α的mRNA水平，又能够抑制HNF4α的蛋白水平，我们可以推测PA可能通过作用于不同的肝细胞核因子从而影响肝细胞的分化和其特异性基因的表达，但其具体的药效作用还需要进一步的实验来探究.

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