拉米夫定与原儿茶酸药物组合体内抗鸭乙肝病毒研究

张建武，马恒，魏一，王玲，孟沫然，韩凤梅，陈勇

（湖北省中药生物技术重点实验室（湖北大学），湖北省生物资源绿色转化协同创新中心（湖北大学），湖北武汉430062）

0 引言

拉米夫定（lamivudine，简称3TC）作为一种口服抗病毒药物是第一个获FDA批准的，它对患者血清HBV(乙型肝炎病毒)-DNA呈现快速显著的抑制作用，但是对抗原的抑制作用较低，而且停药后症状易复发，长期用药会引起DNA聚合酶区YMDD基序变异，可增大病毒对该药的耐受性，因此限制了其临床应用［1-2］.原儿茶酸（protocatechuic acid，PA）具有一定的抗HBV的作用，且叶下珠、丹参、五味子等有效抗HBV的中药提取物中均含有PA，前期有研究表明，PA体外对HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制率高达46.54%，而且对HBsAg和HbeAg均具有一定的抑制作用［3-5］.

本实验室前期研究表明，3TC联合PA可抑制HepG 2.2.15细胞分泌HBV DNA和抗原［6］，同时对HBV X蛋白入核［7］及感染鸭乙型肝炎病毒（DHBV）吸附、进入和感染鸭原代肝细胞［8］均有一定的协同抑制作用，同时还可降低血清AST和ALT［8］.在药动学方面：二者联用后3TC和PA的吸收速度均降低，同时3TC的吸收总量增大，PA消除减慢，即可延长二者其在体内作用的时间［9］.本实验主要是以樱桃谷鸭雏鸭为研究对象，通过感染DHBV进行造模，结合实验室前期的研究，进一步考察3TC和PA药物组合体内抗DHBV的作用及其保肝护肝的作用.

1 材料与方法

1.1 主要试剂 拉米夫定（纯度≥98%）、原儿茶酸（纯度≥98%）购于武汉施瑞科技有限公司；门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂（简称门鸟）受赠于武汉启瑞药业有限公司；阿昔洛韦受赠于邦伦来福药业；重组质粒PCR211-DHBV115（DQ276978片段，含3 024 bp［10］）及DHBV强阳性血清(病毒拷贝数＞5×109/mL)受赠于同济医院临床免疫研究室(质粒拷贝数为7.06×1010/mL)；PCR引物是由上海英骏生物技术有限公司合成；SYBR Green qPCR mix购自于TOYOBO（上海）生物科技有限公司；谷草转氨酶（AST）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、碱性磷酸酶（ALP/AKP）测定试剂盒、白蛋白测定试剂盒（ALB）及总胆红素（TBil）测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所；乙肝表面抗原（HBsAg）测定试剂盒购自于上海自科华生物工程股份有限公司；病毒DNAout购自于北京天恩泽基因科技有限公司.

1.2 主要仪器 TriStar LB941多功能酶标仪（德国Berthold公司）；MJ-Mini Option Real-Time PCR system（美国Bio-Rad公司）；超低温冰箱（法国Jouan公司）.

1.3 动物模型 樱桃谷鸭，1～3日龄(简称雏鸭，雌雄不限），颈静脉采血后分离血清，以灭菌双蒸水作为空白对照、DHBV强阳性血清作为阳性对照，采用荧光定量PCR扩增血清中DHBV DNA特异序列，从而筛选出血清中DHBV DNA拷贝数＜104/mL的雏鸭.筛选后的雏鸭以0.2 mL/只的剂量经腿静脉注射DHBV强阳性血清（DHBV DNA拷贝数＞5×109/mL）进行感染，7 d后，采血分离血清，用RT-PCR筛选拷贝数在108/mL左右的雏鸭，即造模成功的模型动物.

1.4 RT-PCR标曲的制备［11］首先，找出重组质粒PCR211-DHBV115 DNA的保守序列（primer-BLAST软件），根据该保守序列设计出荧光定量PCR检测DHBV引物序列（primer3.0软件）：Ps1 5′-GCCTTAGCCAATGTGTATGATC-3′，Ps2 5′-CGTGCTGAATAAGATAACCTGTG-3′；然后配制一系列的标准溶液(质粒拷贝数依次为103、104、105依次至1010/mL)，再加入DHBV引物，最后进行RT-PCR.PCR扩增条件为：首先94℃预热5 min，再按照94℃50 s，51℃45 s，72℃20 s的条件进行40次PCR扩增循环.以纵坐标为质粒拷贝数对数（log拷贝数），横坐标为样品到达对数期的循环数(Ct值)，分别建立给药周期的RT-PCR标曲：log拷贝数=－0.285 7Ct+13.650，r=0.997 8和不同给药剂量的RT-PCR标曲：log拷贝数=－0.375 7 Ct+13.076，r=0.997 3.

1.5 血清中DHBV DNA定量分析［12］用乙醚将雏鸭麻醉之后，经腿经脉采血0.5 mL，12 000 r/min离心10 min，分离血清，再用一管式病毒DNAout试剂盒提取血清中的病毒DNA进行RT-PCR.根据前期已建立的RT-PCR标曲，可测定待测样品中的DHBV DNA拷贝数.

1.6 体内量-效实验方法［13］实验分组：感染DHBV模型雏鸭对照组（灌胃等量0.85%氯化钠），阿昔洛韦100.0 mg/kg组，门冬氨酸鸟氨酸（简称门鸟）5.0 g/kg组，以及3TC/PA(1∶1)分别为12.5、25.0、50.0、100.0、150.0 mg/kg的合用组，将感染后的雏鸭进行随机分组、每组10只.各组一日灌胃一次，连续灌胃给药14 d.分别在给药之前（T0）、给药后第7天（T7）、给药后第14天（T14）以及停药后的第3天（P3），每只雏鸭经腿经脉采血0.5 mL，然后分离血清进行肝功能相关的生化指标和DHBV DNA拷贝数的检测.

1.7 体内时-效实验方法［14］实验分为感染DHBV模型雏鸭对照组，正常雏鸭对照组，阿昔洛韦100.0 mg/kg组，门鸟5.0 g/kg组，以及3TC/PA(1∶1)50.0 mg/kg合用组，随机分组、每组10只.每日灌胃给药一次，连续给药28 d.对照组灌胃等量0.85%氯化钠.分别于给药前（T0）、给药7 d（T7）、给药14 d（T14）、给药21 d（T21）、给药28 d（T28）和停药5 d（P5），经腿静脉采血，每只0.8 mL，然后分离血清进行DHBV DNA拷贝数和ALT、AST以及DHBsAg检测.

1.8 统计学分析 使用SPSS 17.0统计软件对每组数据进行单因素方差分析.

2 结果

2.1 不同的给药剂量对病毒抑制作用及肝功能的影响 研究不同的给药剂量情况下，血清中DHBV DNA含量的变化，结果见表1.

表1 每组用药前后血清中DHBV DNA的含量（Xˉ±s）

模型对照组和门鸟5.0 g/kg组在用药T0～T14及P3时，血清DHBV DNA含量没有出现显著变化（P＞0.05）.阿昔洛韦100.0 mg/kg组给药T7、T14时血清DHBV DNA含量显著下降（P＜0.05），P3后DHBV DNA含量与用药T14相比显著升高（P＜0.05），出现明显“反跳”.3TC/PA的各个剂量组于用药第T7、T14时对血清DHBV DNA含量均有显著的抑制作用，并且抑制作用随着给药剂量的加大而增强；P3时对DHBV DNA的抑制率分别为15.8%、17.0%、21.7%、20.7%、21.5%，其中25.0、50.0、100.0 mg/kg组P3时DHBV DNA含量无明显反跳，12.5、150.0 mg/kg组有较明显反跳.另外，3TC/PA50.0 mg/kg给药T14及P3时血清DHBV DNA含量均显著低于阿昔洛韦100.0 mg/kg组（P＜0.05或P＜0.01）.

研究了给药剂量对雏鸭肝功能的影响，各组用药前后血清中各项肝功能生化指标测定结果见表2.

表2 各组用药前后血清中肝功能生化指标（Xˉ±s）

结果显示，在T14后，门鸟5.0 g/kg、3TC/PA(1:1)50.0及100.0 mg/kg组血清中的ALT、AST、ALB及TBil与同组给药前水平相比，均显著低于给药前水平（P＜0.05），3TC/PA 25.0 mg/kg组ALB、Tbil亦显著低于同组给药前水平（P＜0.05）；各组AKP活性较用药前均大幅下降，即使模型对照组也不例外（原因尚不明确）；阿昔洛韦100.0 mg/kg组给药前后各项指标（除AKP外）无显著变化（P＞0.05）.另外，T14时50.0 mg/ kg 3TC/PA组AST、ALT和Tbil值亦显著低于5.0 g/kg门鸟组（P＜0.01或P＜0.05）.

2.2 给药周期对病毒抑制作用及肝功能的影响 研究给药期间对血清DHBV DNA、DHBsAg含量的影响，其结果分别见于表3和表4.结果显示，100.0 mg/kg剂量组的阿昔洛韦给药T7～T28及和P5后的血清DHBV DNA含量与同组用药前相比较具有显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后DHBV DNA含量与同组给药T28时的水平相比，出现反跳现象，显著高于给药前水平（P＜0.05）.50.0 mg/kg剂量组的3TC/PA在给药T28内，血清中DHBV DNA的水平均显著低于同组给药前水平（P＜0.01），虽然在P5后DHBV DNA含量出现一定的反跳现象，但与T28时的DHBV DNA水平相比并没有显著差异（P＞0.05）.而且50.0 mg/kg剂量组的3TC/PA在给药T21、T28以及P5的血清DHBV DNA水平均显著低于100.0 mg/kg剂量的阿昔洛韦组（P＜0.05或P＜0.01）.

表3 各组给药前后血清中DHBV DNA的含量（Xˉ±s）

表4 各组给药前后血清中DHBsAg水平（Xˉ±s）

结果显示，100.0 mg/kg剂量组的阿昔洛韦给药T7～T28以及P5后血清DHBsAg含量与同组用药前相比较具有显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后DHBsAg含量与同组T28时的水平相比出现反跳现象，显著高于T28时水平（P＜0.05）.50.0 mg/kg剂量的3TC/PA组给药T7～T28以及P5后血清DHBsAg含量与同组用药前相比较具有显著性降低（P＜0.01），且P5后与同组T28时水平无显著差异，并无明显的反跳.另外，50.0 mg/kg剂量的3TC/PA组在给药的T21、T28及P5的血清DHBsAg水平均显著低于100.0 mg/kg剂量的阿昔洛韦组（P＜0.05或P＜0.01）.

研究给药周期对雏鸭肝功能的影响，各组给药前后血清AST、ALT测定结果见表5和表6.

表5 各组用药前后血清中ALT(U/L)水平（Xˉ±s）

结果显示，100.0 mg/kg剂量组的阿昔洛韦对血清中的ALT含量没有明显的影响（P＞0.05）.5.0 g/kg剂量组的门鸟在给药的T14、T21及T28血清中的ALT值同给药前水平比较均显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），但是在P5后ALT值同组T28时水平相比较，具有明显反跳.50.0 mg/kg剂量组的3TC/PA在给药T7～T28期间的ALT值同给药前水平相比较，均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），并且P5后血清ALT值无明显反跳.另外，P5后50.0 mg/kg剂量3TC/PA组的血清ALT水平亦显著低于5.0 g/kg剂量门鸟组（P＜0.05）.

表6 各组用药前后血清中AST(U/L)水平（Xˉ±s）

结果显示，100.0 mg/kg剂量的阿昔洛韦在给药期间对血清AST值水平没有显著性影响（P＞0.05）.5.0 g/kg剂量的门鸟在给药T14、T21和T28时AST值与给药前水平相比较，均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），同时在P5时AST水平值与T28时水平相比并无显著差异.50.0 mg/kg剂量的3TC/PA在给药T7、T14、T21和T28时AST水平值与同组给药前水平相比较均有显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），在P5后AST值水平具有一定程度的反跳.另外，在给药的T14、T28及P5时，50.0 mg/kg剂量的3TC/PA组血清AST值均显著低于5.0 g/ kg剂量的门鸟组（P＜0.01）.

3 讨论

本实验室前期研究工作表明，3TC与PA的联合给药，当二者的剂量比（质量分数）为1∶1时，对DHBV DNA的抑制作用最好，同时具有较好的保肝护肝作用［12］.本实验选用门鸟［15］为保肝护肝的阳性对照药，阿昔洛韦为抗DHBV的阳性对照药［13］、结合实验室前期的研究，进一步考察3TC和PA药物组合体内抗DHBV及其保肝护肝的作用.

量-效关系研究表明，3TC/PA对血清中DHBV DNA的抑制作用随着给药剂量（12.5～150 mg/kg）的加大而增强，其中100.0 mg/kg和150.0 mg/kg剂量组在P5后DHBV DNA量出现明显的反跳现象.50.0 mg/ kg剂量组在给药的T7～T14期间及P5时DHBV DNA的含量显著低于对照组阿昔洛韦，ALT、AST及Tbil值水平均显著低于门鸟对照组，该结果说明3TC/PA体内抗DHBV的最佳给药剂量为50.0 mg/kg.时-效关系研究表明，在给药的T0～T28期间，3TC/PA在50.0 mg/kg时，对血清中DHBV DNA、DHBsAg、AST和ALT的抑制作用随着给药周期的延长而增强，并且在给药周期中以及P5后血清中DHBV DNA和DHBsAg的水平均显著低于阿昔洛韦对照组，同时血清AST和ALT的水平也显著低于门鸟对照组.该实验结果再次表明，3TC/PA体内抗DHBV的最佳给药剂量为50.0 mg/kg，一方面其抗病毒效果优于阿昔洛韦，另一方面保肝护肝效果优于门鸟.结合早期大量的研究工作，本实验结果进一步证明了3TC联合PA用于抗HBV的科学性与合理性.

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