大鼠坐骨神经损伤后嘌呤P2Y4受体表达变化的实验探究

何旭峰 肖昌松 肖俊霞

大鼠坐骨神经损伤后嘌呤P2Y4受体表达变化的实验探究

何旭峰 肖昌松 肖俊霞

目的 探讨大鼠坐骨神经受损是否会影响嘌呤P2Y4受体表现，对三磷酸腺苷/三磷酸鸟苷(ATP/UTP)对周围受损神经起到的积极作用进行研究。方法 取36只SD大鼠作为研究对象，将36只大鼠随机均分为正常组、对照组以及观察组。对观察组大鼠行一侧坐骨神经切断修复模型，分别在术后1d、1、2、3、4周后处死大鼠，取出部分坐骨神经，脊髓以及神经节。对照组大鼠仅做切口，不进行其他手术；正常组为正常参照对象，同时检测RT-PCR（半定量逆转录-聚合酶链式反应）产物的序列。结果 正常组大鼠与对照组大鼠脊髓与坐骨神经均发现P2Y4mRNA表达［正常组脊髓：（0.215±0.032），坐骨神经：（0.643±0.011）；对照组脊髓：（0.221±0.027），坐骨神经：（0.653±0.012）］；2组对比差异无统计学意义。观察组大鼠坐骨神经切断后，吻合口远端P2Y4mRNA表达呈逐渐变强现象。结论 观察组大鼠坐骨神经切断后，吻合口远端P2Y4mRNA表达呈逐渐变强现象，近端呈逐渐减弱现象。

坐骨神经；P2Y4mRNA；背根神经节

细胞外三磷酸腺苷/三磷酸鸟苷(ATP/UTP)的主要作用为神经递质或神经调质。据了解，ATP/UTP经受体能直接作用于神经系统，有助于促进胶质细胞、轴突组织修复或再生，因此临床多被用来治疗脑外伤或脑缺血性损伤[1]。在周围神经系统中，坐骨神经受损后，细胞外ATP参与促进轴突再生，神经修复等活动。不过现阶段，该作用机制暂时尚不明确[2]。为了进一步研究该作用的机制，进行了此研究，取得了较明确的研究结果，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 取36只SD清洁级雄性大鼠[SCXK (浙)2012-0033]作为研究对象，36只SD大鼠鼠龄2～3个月，体质量120～180g。将36只大鼠随机均分为正常组、对照组与观察组[3]，每组12只。

1．1．2 试剂与仪器

1．2 方法

1．2．1 动物模型制作 正常组大鼠为正常参照组，对照组大鼠仅做切口不进行其他手术。使用1%异戊巴比妥钠对观察组大鼠进行腹腔麻醉，切开大鼠左侧臂肌，充分暴露手术视野，于梨状肌下端寻找到坐骨神经，切断后利用无创缝线缝合切口处外膜，利用缝线于手术切口两侧做标记[4]。对观察组大鼠行一侧坐骨神经切断修复模型，分别于术后1d、1、2、3、4周后处死大鼠，取出部分坐骨神经，脊髓以及神经节。

1．2．2 标本收集 所有大鼠均采用1%异戊巴比妥钠行腹腔麻醉，切开大鼠左侧臂肌，充分暴露手术视野，于梨状肌下端寻找到坐骨神经，切断取出留以备用。并于大鼠背侧行纵切口，借助显微镜，采集部分脊髓与左侧背根神经节。取出后剥离外膜，反复冲洗取出物，与坐骨神经标本一起封存于液氮中，方便实验取用。

1．2．3 RT-PCR（半定量逆转录-聚合酶链式反应） 取备用组织 3mg，研碎后提取 RNA。利用紫外分光光度计测量RNA的浓度，加入AMV逆转录酶充分反应，合成cDNA的第一链。根据参考文献配置PCR引物，上游5c-T GGGTGTTTGGT TGGTAGTA-3，下游5c-GT CCCCCGTGAAGAGAT AG- 3c。将BActin设置为内参对照：上游5c-CCT TCCT GGGCAT GGAGTCCTG-3c，下游5c-GGAGCAATGATCTT GATCTT C-3c[5]。为确保内参数与目的基因存在可比性，可对PCR行扩增处理，使反应进入到平台期以前，于指数增长期就结束。

1．2．4 检测操作 使用琼脂糖凝胶电泳测量PCR水平，利用UVPgrab-it做成像处理，呈像结果经Gelworks ID Advanced V4 01 图像分析软件进行处理。取100μL物电泳后纯化，于ABI PRISM 自动测序仪内，检测序列。

1．3 统计学方法 所有的数据都经过SPSS14．0/PC+软件包加工处理，计量资料采用“x±s”表示，使用t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 正常组与对照组大鼠检测结果 检测结果显示，2组大鼠脊背与坐骨神经均检测到在P2Y4嘌呤受体，且显示有规律性，2组大鼠脊神经节均不存在有规律片段［正常组脊髓：（0．215±0．032），坐骨神经：（0．643±0．011）；对照组脊髓：（0．221±0．027），坐骨神经：（0．653±0．012）］，2组对比差异无统计学意义。

2．2 P2Y4mRNA 表达的规律 PCR经逆转录处理后，取出464bp的片段；B-Actin获得205bp片段。这些片段均能在正常组大鼠的脊髓（0．217±0．023）、神经近端（0．655±0．022）与远端（0．656±0．011）中检测到。观察组大鼠坐骨神经切断后，吻合口远端P2Y4mRNA表达呈逐渐变强现象［脊髓：1周（0．431±0．022），2周（0．521±0．014）；神经近端：1周（0．499±0．014），2周（0．382±0．047）；神经近端1周（0．825±0．054），2周（0．918±0．015）］。

3 讨论

Aonok等在1990年发现ATP等和其代谢产物，可通过受体提高细胞内游离钙离子的浓度对PC12细胞发挥保护作用[6]，嘌呤能受体由Burnstock于1978年被正式命名[6]，根据组织反应类型与催化剂功能强度，发现P2嘌呤受体可被归为P2X和P2Y2大类型。P1型受体主要介导nine和AMP的作用，P2受体主要介导P2X和P2Y2大类型。P2X受体主要分布在中枢神经系统、平滑肌细胞、支气管上皮等，P2Y受体主要集中在中枢神经系统、血管内皮细胞等部位，用于参与细胞增殖与分化活动。坐骨神经中，主要存在P2Y2、P2Y4和P2Y6这三大类P2Y亚型受体。通过多年研究经验不难发现，鼠类P2Y4受体和人类的P2Y4受体基因序列吻合度高达84%，且绝大多数序列都处于跨膜去与胞外环，具有参考价值。P2Y4受体主要分布于大鼠脑组织与脊髓内，能促进中枢受损细胞再生与修复。P2Y4受体在肝内胆管、胆囊上皮及空肠上皮，促进氯离子的分泌。本研究结果显示，P2Y4受体可在脊髓灰之中表达，表达主要集中在前交运动神经元与中央管上皮细胞，且于白质中呈阴性，且脊髓、背根神经节及坐骨神经有恒定表达[7]，这一实验结果与本研究预测实验记过基本相符。经序列测定，结果显示与现有文献研究结论完全吻合[8]。该实验结果提示，正常SD大鼠脊髓与坐骨神经中，均能检测到受体表达，而脊神经节中未发现受体表达。由此推断，仅做切口不行手术，不会影响P2Y4mRNA的表达。脊髓内表达在2周内达到最活跃状态，4周后逐步接近正常值[9]。这主要是由于骨神经损伤的保护性作用，参与了维持脊椎神经元的存活，从而有利于周围神经的再生。

RT-PRC是一种灵活度很高的实验技术，为了达到保证内参和目的基因的可比性，实验对PRC进行扩增。经过长时间的观察，推测ATP/UTP通过P2Y4受体参与了周围神经损伤后的病例调理与改变，在神经修复中起重要作用。

[1] 吴银生，王冠华，徐华梓，等．嗅鞘细胞促进大鼠坐骨神经损伤后神经功能恢复[J]．浙江创伤外科，2011,16（6）：721-725．

[2] 吕兰，张长杰，黄德清．脉冲电磁场对大鼠坐骨神经损伤的作用研究[J]．福建医药杂志，2012，34（3）：67-70．

[3] 王晓亮，杨朝阳，李晓光，等．应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究[J]．中国康复理论与实践，2012，18（6）：535-538．

[4] 高玉峰，姚斌彬，吴剑聪，等．推拿对大鼠坐骨神经损伤后MAP-2和NF-M表达的影响[J]．中医药导报，2014（1）：11-13．

[5] 王卒平，刘啟蒙，况勇，等．人神经营养素4治疗大鼠坐骨神经损伤效果观察[J]．中国现代医学杂志，2012，22（4）：20-23．

[6] Aonok,Nakanishi N,Yamada S,et al．Increase in intr acellula r Ca2+ level and modulation of nerveg rowth facto raction on pheochromo cytoma PC12 cells by extr acellular ATP[J]．Meikai Daigaku shigaku zasshi,1990,19(2)：221-229．

[7] 方欣，周朋，闫旭升，等．人参皂甙Rg1促进大鼠坐骨神经损伤后再生的作用[J]．解剖学杂志，2013,36（1）：70-73．

[8] 刘强，王德国，梁茂华，等．曲安奈德对SD大鼠坐骨神经损伤后功能恢复影响的实验研究[J]．中国矫形外科杂志，2012，20（6）：556-558．[9] 陈宣煌，郑祖高，占鲤生，等．胆囊收缩素对大鼠坐骨神经损伤后修复的影响[J]．南昌大学学报：医学版，2012,52（7）：4-7．

10．3969/j．issn．1009-4393．2015．18．008

湖南 421002 衡阳核工业卫生学校 （何旭峰 肖昌松 肖俊霞）