1H NMR检测技术结合PCA及OPLS在SLE疾病发生、发展中的应用研究

彭华明 王悦宁 王艳梅

1H NMR检测技术结合PCA及OPLS在SLE疾病发生、发展中的应用研究

彭华明 王悦宁 王艳梅

目的 了解1H NMR检测技术结合模式识别技术-主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘法方法(OPLS)在系统性红斑狼疮（SLE）疾病发生、发展中的应用价值。方法 采用瑞士Bruker 600MHzNMR谱仪，对34例健康志愿者（对照组）与62例SLE患者（观察组）血清样本进行检查，基于把握代谢物差异基础上取代谢物指纹图谱，综合模式识别分析方法，建立SLE诊断模型。结果 SLE对氨基酸、脂类、能量代谢具有影响作用。PCA可对观察组与对照组进行区分，PLS-DA模型预测率达0.393，OPLS-DA模型诊断特异性达97.1%左右，敏感性达60.9%左右。结论 利用1H NMR检测技术及PCA及OPLS，强化SLE疾病监测，能够指导临床治疗，改善患者预后。

1H NMR检测技术；PCA；OPLS；SLE疾病

SLE作为临床上一种常见的自身免疫性疾病，多表现为免疫性炎症，易波及多器官、多系统，目前病因尚未完全清晰，根治疗法欠缺[1]。近年来，伴随着基因组技术的不断发展，应用微阵列技术对SLE外周血基因表达谱进行研究，筛选SLE有关基因，证实临床免疫表型谱与SLE基因表达谱具有关联性[2]。本研究选取健康志愿者与SLE患者外周血清样本中的内源性代谢物，立足于机体病理变化角度，综合1H NMR检测技术及 PCA与OPLS等分析方法，探究SLE疾病发生、发展过程，旨在分析代谢组学在SLE发病机制中的应用价值。相关报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择坪山新区人民医院于2012年3月～2014年3月收治的62例SLE患者为观察组，与1997年美国风湿病学制定的SLE临床诊断标准吻合，其中男12例，女50例，年龄22～65岁，平均(45.67±4.78)岁。另择取同期来体检的

34例健康志愿者为对照组，男9例，女25例，年龄21～68岁，平均(47.78±3.05)岁。2组患者年龄、性别等一般资料对比差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集标本方法 严格执行规范程序，于清晨抽取外周静脉血3mL，置入生化管内，待静置0.5h后，采用3000r/ min的速度离心10min后留取500μL上清液，置入冰箱（-80℃）内保存。

1.2.2 检测方法 待室温冻融标本后留取血清200μL溶于重水200μL中。将核磁管（5mm）置入混合液中，在瑞士Bruker 600MHzNMR谱仪上进行样本一维及二维氢谱，开展维水峰抑制实验，择取标准预饱，并选择压水NOESY1DPR序列，RD（弛豫延迟）设置为2.5s，tm（混合时间）设置为100ms，累记次数达128次，对RD与tm进行对水处理，做好饱和照射。采集时间约0.95s，温度维持25℃，谱宽达8384Hz。

1.3 统计学方法 采用TopSpin软件傅立叶变换谱图，并进行相位调整、定标处理等，同时对代谢物进行鉴定与量化处理，建立指纹图谱，采用模式识别分析法构建并验证LN与SLE诊断模型。

2 结果

2.11H NMR图谱分析 经由检测发现，观察组谱图与对照组谱图具有相似点，其差异信号主要为氨基酸与脂肪区域，其中关键差异代谢物源于某些脂质代谢片段，包括L10、L9、L8、L7、L6。而高密度脂蛋白、磷酸胆碱、胆固醇水平出现下降，极低密度脂蛋白（包括L5、L3）与低密度脂蛋白（包括L2、L4）水平呈上升态势，生糖氨基酸（包括谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸）及生酮水平呈下降趋势，其他代谢物（包括肌氨酸酐、丙酮酸、柠檬酸、甲酸、谷氨酸盐、肌酸）信号衰退。

2.2 PR变化分析 依据PCA分析结果，构建PC1与PC2得分图，其中PC1占总变量的76.6%，PC2占总变量的10.9%，区分观察组与对照组，获取PLS-DA模型得分图，经由排序验证（200次）获取最终验证图。结合OPLS-DA诊断模型得分图，可观察组间的差异性，其对疾病的敏感性为60.9%左右，特异性达97.1%左右。

3 讨论

随着医疗水平的不断发展，代谢组学技术在临床研究上得到广泛推广，多以NMR为依据，综合模式识别分析方法，建立机体代谢指纹图谱，可对疾病病理状态进行详细区分，与单一标志物相比较，其对疾病诊断更具有应用价值[3]。

本研究以SLE患者为研究对象，通过构建血清代谢物指纹图谱，深入探究疾病诊断方法，依据NOESY1DPR谱图可得，SLE患者与正常人群血清代谢物差异多表现在氨基酸与脂质区域。针对脂质区域而言，HDL出现下降现象，且VLDL、LDL呈上升态势，与以往研究具有一致性，充分表明SLE极其容易诱发脂质代谢失衡。一般而言，针对SLE患者而言，其血清氨基酸水平出现下降现象，其中涵盖生酮（氨基酸）、生糖、柠檬酸（三羧酸循环中间代谢产物）均呈下降态势，同时丙酮酸（糖酵解中间产物）亦减少，表明SLE患者能量代谢处于失衡状态。究其根源，可能由于增强蛋白质分解代谢后，基于炎症状态下，导致能量需求上升[4-6]。相关文献报道指出，针对SLE与RA患者而言，其血清中的组氨酸水平与正常人比较，呈下降态势[7-9]。由此可见，以往单一代谢物无法成为SLE特异标志物，基于把握代谢物改变信息基础上，才能对SLE患者疾病状态进行区分。

本研究结合模式识别分析方法，对收集的代谢物信息进行综合判断后经由PCA得分图提示，正常人群与SLE患者区分明显，表明在血清代谢物轮廓上，健康人群与SLE患者差异显著。而结合PLS-DA得分图对此进行验证，模型预测率为0.393，充分证实这一结论的准确性。为了避免非实验因素对其形成干扰，故对PLS-DA得分图进行正交滤噪处理，获取OPLS-DA得分图，可对健康人群与SLE患者进行最优化区分，凸显2组差异性，模型验证特异性与敏感性较高[10]。本研究结果提示，综合血清差异代谢物建立诊断模型，可对健康人群与SLE患者进行区分，得分图提示代表健康人群的点处于集中状态，而SLE组呈离散状态，可能由于SLE出现活动期与缓解期，加上易诱发系统并发症，故表现于此，有待后续强化验证[11]。

整体上来讲，综合代谢组学技术分析SLE患者外周血清标本，可区分正常人与SLE患者血清的代谢轮廓。结合模式识别分析方法，强化海量数据综合分析，可对正常人与SLE患者进行区分，从而构建敏感性与特异性均高的诊断模型，表明代谢组学已成为了一种全新的SLE诊断方法，可研究SLE发病机制，补充基因与转录组成果[12]。

综上所述，1H NMR检测技术结合PCA及OPLS在SLE发病机制研究中具有重要的应用价值，值得临床推广与应用。

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doi∶10.3969/j.issn.1009-4393.2015.13.028

广东 518118 广东省深圳市坪山新区人民医院内科 （彭华明 王悦宁） 518000 广东省深圳市龙华新区中心医院ICU （王艳梅）