Rett综合征临床分析及甲基化CpG结合蛋白-2基因调查

程 芹，吕康模，康 涵，邓 佳，刘 平，蒋利萍

（1.重庆医科大学，重庆400016；2.重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院，四川610031；3.重庆医科大学附属儿童医院免疫研究室，重庆400014）

Rett综合征临床分析及甲基化CpG结合蛋白-2基因调查

程 芹1，2，吕康模2，康 涵2，邓 佳2，刘 平2，蒋利萍3

（1.重庆医科大学，重庆400016；2.重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院，四川610031；3.重庆医科大学附属儿童医院免疫研究室，重庆400014）

目的探讨甲基化CpG结合蛋白2（MECP2）基因突变在4例疑似Rett综合征（RTT）患者中的致病作用及基因测序对协助诊断RTT的意义。方法选择2014年4～8月重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院收治的4例疑似RTT患者，即病例1、2、3、4，病例1为家族先证者，病例2为病例1的母亲，病例3、4为散发患者，家系依次为A、B、C。对4例患者进行临床资料分析、家系调查、核型分析等，并对患者及其父母MECP2基因进行聚合酶链反应扩增测序。结果病例1、4通过2010年最新RTT的修订诊断标准及基因诊断确诊，病例2、3的临床诊断不成立但发现致病基因突变，病例1、2为国内首例母女同患RTT，其MECP2基因测序为同一个国内未报道的突变位点，病例3、4家系中发现已有文献报道的致病位点突变。结论RTT临床诊断可能与基因诊断结果不一致，基因诊断对确诊RTT，尤其是临床症状不典型的病例具有重要价值；疑诊患者早期完成基因诊断可降低医疗成本、早期开始康复训练并辅助优生优育。

Rett综合征； 基因； 序列分析； 遗传咨询； 甲基化CpG结合蛋白-2

Rett综合征（Rett syndrome，RTT）是一种严重影响儿童智力运动发育的疾病，1966年由Rett[1]首先报道，该病主要发现于女童，为女性智力发育迟缓的较常见病因，男性中罕见，女性人群发病率为1/10 000~1/15000，其中绝大部分为新发病例，仅有0.5%~1.0%为家族遗传。1999年Amir等[2]发现，RTT与定位于Xq28的甲基化CpG结合蛋白2（methyl CpG binding protein 2，MECP2）基因相关。本研究通过对就诊患者进行临床资料分析、家系调查、核型分析并对患者及父母的MECP2基因进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增测序，探讨MECP2基因突变在RTT患者中的致病作用及基因测序对协助诊断RTT的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年4～8月重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院收治的疑似RTT患者4例，即病例1、2、3、4，年龄分别为3岁零4个月、33岁、1岁零9个月、4岁零10个月，均为四川地区人员；病例1、2为母女，病例3、4为散发患者。家系依次为A、B、C。本研究通过重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院伦理委员会审批，所有受检者及家属知情同意并签字。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断 采用2010年最新RTT的修订诊断标准进行临床诊断。

1.2.2 家系调查 观察4例患者及父母相关临床表现，并搜集血样标本进行检测。

1.2.3 核型分析 采集患者及父母静脉血3 mL，用肝素抗凝，培养制片，送重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院产前诊断中心阅片。

1.2.4 基因测序 采集患者及父母静脉血2 mL，用乙二胺四乙酸抗凝，采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京BioTeke）进行基因组DNA提取。根据美国国立生物技术信息中心数据库MECP2（NM_001110792）参考序列设计引物，MECP2-1：上游引物为5′-AGTAATTTGCAGCTTATCCTT-3′，下游引物为5′-TGGCACAGTTATGTCTTTAG-3′，扩增目的片段为438 bp；MECP2-2：上游引物为5′-GCCTCTGCTCACTTGTTCTG-3′，下游引物为5′-ACACCTGGTCTCAGTGTTCATT-3′，扩增目的片段为551 bp；MECP2-3：上游引物为5′-CACCATCCGCTCTGCCCTAT-3′，下游引物为5′-GCAATCCGCTCCGTGTAAAGT-3′，扩增目的片段为1 250 bp。使用Roche PCR Master试剂盒进行PCR，扩增体系为30 μL，反应液混匀瞬时离心后使用BIO-RADS1000型PCR仪进行扩增反应，扩增程序为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证后送英潍捷基（上海）生物技术有限公司进行双脱氧链终止法测序。测序结果与标准序列（NM_001110792）进行比对。

2 结 果

2.1 临床特征 （1）病例1：女，3岁零4个月。因进行性语言倒退1年就诊。入院前1年，患儿无诱因出现语言倒退，不愿说话，喜吃手，喜将5个手指全部放入口腔中，睡醒时有双目凝视，四肢抖动，持续约数秒后缓解，缓解后无烦躁不安、意识模糊、疲劳感等。入院前1+年曾被重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院诊断为“孤独症”。多次检查提示异常脑电图。（2）病例2：女，33岁。因生育RTT女儿要求检查就诊。就诊时丧失语言能力及目的性肢体活动能力，喜绞手，不能独立行走。既往史：曾于2岁时发生严重跌倒创伤，诊断为“颅脑损伤”，后开始出现肢体活动异常。家族史：2个哥哥、1个姐姐表型无异常，患者生育RTT女儿，即病例1。（3）病例3：女，1岁零9个月。因智力发育迟缓1+年就诊。喜将手放入口腔，未习得语言能力，目的性肢体活动功能退化，不能示物，步态不稳。既往史：5个月时患“肺炎”，后开始出现四肢肌张力下降。生产史及家族史无特殊。（4）病例4：女，4岁零10个月。因运动语言进行性退化3+年就诊。喜弹指，语言及目的性肢体活动功能退化，就诊时可唤“爸爸、妈妈”。既往查脑电图见癫痫波。生产史：孕1产1，因“过期产”行剖宫产娩出，家族史无特殊。病例1、4符合RTT诊断标准，病例1为非典型RTT，病例4为典型RTT，按疾病分期分别处于疾病Ⅱ、Ⅲ期。病例2、3符合排除标准，故临床诊断不成立，见表1、2。

表1 4例患者临床特征及诊断标准

表2 典型RTT症状分析

2.2 家系遗传分析 家系A系罕见母女遗传致病基因发病，家系B、C为散发患者，无家族史。家系C因个人原因拒绝家族其他成员采血进行分析，家系A、B遗传图谱见图1。

图1 家系A、B遗传图谱

2.3 家系染色体分析 3个家族共4例患者、5例直系血亲染色体分析均为正常核型，除外染色体疾病，见表3。

表3 4例患者家系核型、基因及表型调查结果

2.4 4例患者家系核型、基因、临床症状调查 4例患者均发现MECP2基因突变，全部为杂合性突变，突变率为100%。病例1、2突变位点相同，二者第1157～1200位核苷酸出现44bp核苷酸缺失，表示为c.1157～1200del 44 bp；相应氨基酸转录发生截短。病例3第808位核苷酸C＞T无义突变；病例4第502位核苷酸C＞T无义突变，二者氨基酸转录终止。4例患者均为已报道突变，见图2、3，表3。

图2 病例1、2 MECP2基因检测结果

图3 病例3、4 MECP2基因检测结果

3 讨 论

RTT为女性智力发育迟缓的较常见病因，常见于女童，女性发病率为1/10 000～1/15 000。目前，RTT的诊断主要依靠临床表现，重庆医科大学附属成都市妇女儿童中心医院收治的4例患者均符合诊断标准中的4条主要标准（符合率为100%），故纳入检测。但随后病史采集中发现，病例2曾于2岁时受严重颅脑损伤，损伤后出现神经运动发育异常，伤后以“颅脑损伤”随访，未给予特殊治疗，本病例符合RTT排除标准的第1条。病例3小于6个月龄时有肺部感染病史，随后发现肌张力下降、语言发育迟滞等异常表现，发病年龄与排除标准的第2条相符。二者RTT临床诊断不成立。进一步染色体检查除外二者染色体病变，病例3 MECP2基因检测发现了已有文献报道致病的突变位点，病例2发现了新发突变并生育了典型RTT患儿。据此，作者认为，对具有诊断RTT主要标准或符合排除标准者，应将基因诊断归为重要辅助诊断标准，如本研究中病例1、2患者如无基因诊断的确诊，均可能继续按“孤独症、颅脑损伤”等疾病治疗，延长了诊治时间，增加了家庭经济负担及医疗资源费用。

RTT系X连锁显性遗传疾病，发病原因多与MECP2基因突变有关。MECP2基因定位于人类染色体Xq28，包含4个外显子，已发现的突变达200余种，主要突变部位为3、4外显子。MECP2是丰富的染色质结合蛋白，含有甲基化CpG结合区及转录抑制区，在神经发育过程中通过转录水平调控影响基因功能。张晓英等[3]研究发现，RTT患儿MECP2突变率为87.5%（308/352），热点突变主要包括p.T158M[15.6%（55/352）]、p.R270X、p.R255X、p.R306C、p.R294X、p.R133C、p.R106W、p.R3066C、p.R3066C、p.G269fsX288[4.3%（15/352）]及大片段缺失[6.0%（21/352）]。本研究发现，国内首例母女同患RTT，该病仅0.5%~1.0%为家族遗传，本病例在国际上也属罕见。对其家族调查发现，MECP2基因新发突变c.1157~ 1200 del 44 bp，国内尚无该突变的文献报道，但在已发现突变中有邻居位点突变 c.1152 del 44 bp、c.1158~ 1167/1171~1186 del、1164 del 44 bp等的文献报道，国外仅1例该突变致RTT的文献报道[4]，但非家族遗传，作者认为，该位点突变应考虑为病例1、2致病的根源，其出现罕见家族遗传现象可能与该新发突变位点表达相关。国内目前有MECP2基因突变母女遗传的文献报道[3]，但不同于本研究，已有文献报道的家系中仅有患儿发病，母亲表型正常。该类罕见RTT遗传机制尚不确切，MECP2突变除对下游靶基因脑源性神经营养因子起作用而致病外[5]，不同MECP2基因突变在表达通路上的差异尚需进一步研究。

病例4为本研究中唯一1例典型RTT患儿，且临床与基因检测结果相符，基因检测为热点突变之一，与大量文献报道相符。

MECP2基因致病性突变在女性中主要表现为RTT，典型男性RTT患儿罕见，偶有文献报道。目前，对有智力运动发育异常的男性患儿进行MECP2基因检测，在 Angelman综合征[6]、孤独症[7]、精神发育迟滞[8]等患儿中均发现致病性突变，提示MECP2基因突变在男性与女性之间可有不同表型，但具体原因仍待进一步研究。另有文献报道，少数RTT致病性突变与细胞周期依赖激酶5[9]、FOXG1（Forkhead box G1）[10]基因相关。

已有的家族遗传RTT的文献报道中均为母系遗传，因此，除致病性突变MECP2基因遗传外，Naidu等[11]提出了应该对线粒体遗传物质进行分析的假设，孟洪弟等[12]报道3例RTT患儿融合细胞线粒体见空泡改变，以琥珀酸为底物时氧耗降低34.0%，唐炬等[13]对15例RTT患儿及其中14例母亲进行的研究发现，13例患儿及11例母亲存在线粒体突变，线粒体DNA突变可考虑为有家族史的RTT的另一致病原因。

RTT目前尚无有效根治方法，早期康复治疗是改善运动姿势、减轻关节变形、肌肉萎缩的主要手段。对睡觉障碍者可给予曲唑酮、水合氯醛诱导睡觉，左卡尼汀（左旋肉毒碱）维持睡眠。维生素D对改善骨骼发育迟缓及减轻骨骼变形可能有效。有癫痫症状者给予左乙拉西坦等常规抗癫痫治疗多数有效。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂可改善患儿焦虑情绪及异常活动姿势[14]。西甲硅油可减轻腹胀及胃食道反流，聚乙二醇3350、氢氧化镁混悬剂可改善便秘。阿片、苯二氮类药物可调节呼吸节律。

RTT临床表现多与孤独症相似，为常规鉴别诊断项目，颅脑损伤或感染亦可出现类似症状，难以鉴别，本研究病例2系颅脑损伤伴RTT患者，生育典型RTT患儿（病例1），2例患者对其家庭造成了沉重负担，故临床疑似RTT患者应尽快进行基因筛查，以降低医疗成本，早期开始康复训练，对高风险孕妇进行胎儿基因分析及遗传咨询可辅助优生优育。

[1]Rett A.On a unusual brain atrophy syndrome inhyperammonemia in childhood[J].Wien Med Wochenschr，1966，116（37）：723-726.

[2]Amir RE，Van den Veyver IB，Wan M，et al.Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2，encoding methyl-CpG-binding protein 2[J]. Nat Genet，1999，23（2）：185-188.

[3]张晓英，赵滢，包新华，等．中国人群Rett综合征的遗传特点与机制研究[J]．中华医学遗传学杂志，2014，31（1）：1-5．

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Clinical analysis of Rett syndrome and a research of methylation CpG binding protein-2 gene

Cheng Qin1，2，Lu Kangmo2，Kang Han2，Deng Jia2，Liu Ping2，Jiang Liping3
（1.Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chengdu Women′s &Children′sCentralHospital，Chengdu，Sichuan610031，China；3.Immune Laboratory，Affiliated Children′s Hospital of Chongqing MedicalUniversity，Chongqing400014，China）

ObjectiveTo explore methylation CpG binding protein-2 gene mutation′s pathopoiesia effect on 4 suspected Rett syndrome（RTT）patients and gene sequencing′s significance in assist diagnosing RTT.MethodsSelected 4 suspected RTT patientsadmitted in Chengdu Women′s&Children′sCentralHospitalfrom ApriltoAugust，2014，i.e.case1，2，3，4.Case 1 was family propositus，case 2 was case 1′s mother，case 3 and 4 were sporadic patients，pedigree was successively A，B，C.Did clinical data analysis，pedigreeinvestigation，karyotypeanalysison4patients.Didpolymerasechainreactionamplification sequencingon patients andtheirparents'MECP2gene.ResultsCase1and4wereconfirmedbythelatest2010RevisedRTTdiagnosticcriteriaand geneticdiagnosis.Case 2 and 3′s clinical diagnosis was disconfirmed but virulence gene mutation was discovered.Case 1 and 2 were the first case that mother and daughter both had RTT in our country，and their MECP2 gene sequencing was the same mutation site that hasnotbeenreportedinourcountry.Pathogenicsitemutationthathasbeen reported wasdiscovered in case3 and 4′spedigree.ConclusionRTT clinical diagnosis might be different from gene diagnosis.Gene diagnosis has a great value in confirming RTT，especially those have nontypical clinical symptoms.Suspected patients can reduce medical cost，start rehabilitation training early，and assistprepotencybycompletegenediagnosisatanearlystage.

Rett syndrome； Genes； Sequence analysis； Genetic counseling； Methyl CpG binding protein 2

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.11.005

：A

：1009-5519（2015）11-1613-04

2015-03-03）

程芹（1989-），女，四川广安人，硕士研究生，主要从事肾脏内科临床工作；E-mail：chengqin2015@sina.com。

吕康模（E-mail：892037344@qq.com）。