蛋白质组学实验技术及其应用

赵 静，王宏伟，田二杰，周变华

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

蛋白质组学（proteomics）就是从整体水平上来认识蛋白质的存在及活动方式（表达、修饰、功能、相互作用等），从而更好的阐明生命科学本质的学科［1］。蛋白质组学本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，囊括了由一个细胞乃至一个机体的基因组所表达的全部蛋白质［2］。通过将病理个体或处理样本与对照样本进行蛋白质组比较分析，可以找到差异表达蛋白分子及其信号通路，进而为揭示生命本质、疾病的早期诊断和新药设计提供分子标志。蛋白质组学相关实验技术的成熟和发展使这门学科得到了不断的进步和完善，不仅为探索生命奥秘提供了理论和技术支持，并且为阐明疾病机理、保障人和动物健康提供了理论根据和解决途径［3］。

1 双向电泳技术

1.1 双向电泳技术的原理

双向电泳（two－dimensional electrophoresis，2－DE）是蛋白质组学研究中的重要分离分析手段，能够提高细胞内蛋白质分离的分辨率，并反映机体的蛋白质表达水平及转译后的修饰状况［4］。经典双向电泳由Klose和O＇Farell在1975年建立，该技术首先根据蛋白质的等电点使蛋白质在载体两性电解质（carrier ampholytes，CA）pH 梯度胶中进行等电聚焦，然后按照分子量大小在SDS－PAGE中进行第二向分离。电泳后的样品可进行考马斯亮蓝染色、银染、荧光染料染色等不同方法染色，一般认为，银染比考马斯亮蓝染色的灵敏度高，但后者价格低廉，操作简单且重复性好，与胶内酶解及质谱鉴定兼容性好，所以仍然是实验室最常用的染色方法。使用荧光染料的灵敏度与银染相当，对质谱的干扰较小，但需要配备昂贵的实验设备。获得处理好的凝胶后，存储凝胶图像获取完整的蛋白定性和定量信息，依靠图像分析软件来完成蛋白质各种信息的分析。

1.2 双向电泳技术的特点及应用

2－DE具有简便、快速、高分辨率等优点，但同时也有自动化程度低，重复性差，以及对过大和过小分子量的蛋白质、低丰度蛋白质、极酸或极碱和难溶的蛋白质如膜蛋白等分离困难的缺点。固相pH梯度的凝胶电泳的建立和完善，克服了以前使用CA的不足，使电泳技术的加样量、重复性有了明显改善，并进一步提高了疏水蛋白、低丰度蛋白及碱性蛋白的分辨率［5］。

一直以来，传统的双向电泳技术无法对两个蛋白质样品的差异进行检测与定量，因而不能应用于大规模的蛋白组学分析，但差异凝胶电泳技术的建立与使用却弥补了这一缺陷。差异凝胶电泳是对2－DE在技术上的改进，结合多重荧光分析的方法，用分子量相匹配的不同荧光染料标记两个蛋白样品，再取等量混合后进行内标，最后进行双向电泳，通过检测凝胶上的不同荧光而实现对不同样品间差异的检测。该方法灵敏度精确性较高，增加了不同样品因生物学变化而导致差异的可信度。现代技术的发展，使双向电泳技术可以与包括质谱技术在内的新方法联用，已在细菌［6］、植物［7］、昆虫［8］等生物学领域中广泛应用，尤其是在与人类疾病相关的蛋白组研究中，例如Luczak M等［9］利用2－DE和质谱技术（mass－spectrograph，MS）技术发现了急性粒细胞白血病未分化型／部分分化型（AML－M1／M2）患者与健康对照者之间的25种差异蛋白，并提出了可能为急性髓细胞白血病（AML）潜在的生物标志物的5种蛋白质。

2 免疫共沉淀技术

2.1 免疫共沉淀技术的原理

免疫共沉淀（co－immunoprecipitation）是蛋白组学中用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。该技术以抗体和抗原之间的特异性结合为基础，不仅能够确定生理条件下细胞或组织内2种目标蛋白质是否存在相互作用，还可以探究与已知相互作用的蛋白［10］。它的基本原理是在非变性条件下裂解细胞，保留细胞内存在的相互作用蛋白质，将目的蛋白的抗体加入细胞裂解液中，使目的蛋白在体内的相互作用蛋白沉淀下来。经过洗脱，收集沉淀物并进行分离，最后对分离所获的蛋白进行鉴定。该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下蛋白质间的相互作用。

2.2 免疫共沉淀技术的的特点及应用

免疫共沉淀技术主要用于紧密结合的相互作用蛋白质研究，对于瞬时或低亲和力的相互作用蛋白研究相对较少。其原因是目的蛋白质只有达到一定的浓度才能与抗体结合形成复合体沉淀，而且要求复合体在一系列的清洗过程中应保持不变，所以该方法仅适用于从细胞中溶解出来后仍为生理复合体的蛋白质。Zolotnik I A等［11］就利用免疫共沉淀技术验证细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling－3，SOCS－3）与胰岛素受体β亚单位（insulin receptorβ－subunit，IR－β）和 SOCS－3与胰岛素受体底物－1（insulin receptor substrate 1，IRS－1）的相互作用的增强会导致IR－β与IRS－1的相互作用减弱，而这可能是磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3－K）在 肥 胖Zucker鼠骨骼肌中活性降低的原因。此外，将免疫共沉淀技术与双向电泳、质谱技术的联合应用与蛋白质与蛋白质相互作用研究，能够获得更加广泛和准确的信息。

3 酵母双杂交系统

3.1 酵母双杂交技术的原理

酵母双杂交系统（yeast two－hybrid system）是一种较为简便、灵敏和高效的，在酵母体内分析蛋白质－蛋白质相互作用的基因系统，由Fields和Song等在研究真核基因转录调控中提出建立。该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DNA结合结构域（binding domain，BD）识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域（activation domain，AD）启动所调节的基因的转录这一原理，将已知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告基因；反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样，通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。

3.2 酵母双杂交技术的特点及应用

该方法在研究蛋白质相互作用方面具有诸多优点：①酵母双杂交杂交系统以生长速度较快的酵母作为报道菌株，具有转化方法简单、效率较高的特点，而且对许多微弱或短暂的蛋白质相互作用具有较高的敏感度，可借助报告基因在表达过程中的多级放大效应反映出来；②因融合蛋白之间的相互作用在真核酵母活细胞内进行，这样蛋白质经过翻译后修饰，可能保持天然的空间构象和折叠状态，更接近细胞内的真实情况，多种营养缺陷标记易于筛选，使试验结果更加真实可靠。但是该技术也存在许多问题，例如依赖于翻译后修饰的蛋白质相互作用一般不适用此方法，因为激活报告基因的相互作用的蛋白质必须定位于核内，而且假阳性及假阴性问题也不可忽视。

为了对这种技术进行比较和优化，Caufield J H等［12］做了一系列试验，证明3次酵母双杂交法就可以检测出一组标准互作蛋白集的78%，而进行第4次检测更是可以将结果提升到83%，说明多次酵母双杂交试验足以检测出系统中大部分相互作用蛋白。该方法目前在蛋白质相互研究中应用广泛，不仅可以检验已知蛋白质之间的相互作用甚至微弱短暂的作用，还可以从cDNA文库中筛选靶蛋白的相互作用蛋白。通过建立蛋白相互作用图谱，可用于确定基因治疗中多肽类药物的作用靶点［13－16］。酵母双杂交系统的许多相关研究方法与技术也已得到了改进和完善，目前以衍生出单杂交系统、三杂交系统、核外双杂交系统、反向双杂交系统、哺乳动物双杂交系统等，为蛋白质组研究提供了丰富的技术平台。

4 蛋白质芯片技术

4.1 蛋白质芯片技术原理

蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，能够进行高通量的蛋白功能分析。该技术实现的基础是蛋白探针在固相支持物（载体）表面的大规模集成，利用样品中标记或未经标记的靶蛋白分子与探针进行反应，然后通过荧光法、放射性同位素法或无标记检测法等相应的方法进行检测，最后由计算机分析结果，获得高丰度表达蛋白。

4.2 蛋白质芯片技术的特点及应用

蛋白质芯片的特异性强，敏感性高，并且具有高通量、重复性好、应用性强等优点，也面临着一些挑战，例如需要大量的蛋白质探针，且探针蛋白的空间结构和活性影响着蛋白质芯片的稳定性和保质期，检测的特异性也受到相似蛋白在交叉配对上的影响。

目前，蛋白质芯片反应结果的检测包括多种方法，其中荧光标记技术成熟、简便、安全，灵敏度能满足绝大多数需求，放射性同位素标记也是传统检测中常用的手段之一，但SELDI－TOF－MS（表面加强激光解吸离子化－飞行时间质谱法）技术作为直接检测法的无标记模式，在蛋白质天然活性检测方面有着特别的优势，成为了生命科学领域中蛋白质组学研究 的 有力工具［17－18］。Zhao L 等［19］通 过 SELDITOF－MS与蛋白质芯片联用技术，发现在低、中、高砷暴露组中的血清中存在20种差异显著蛋白，并且高砷组与低砷组之间的差异蛋白明显多于高砷组与中砷组之间的差异蛋白，在蛋白组水平上证实了砷的毒性作用，为该技术在环境毒理学中应用提供了思路。

5 同位素标记相对和绝对定量技术

5.1 同位素标记相对和绝对定量技术原理

同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项体外同位素标记技术，可以同时使用8种（或4种）不同的同位素试剂来标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。这些试剂分别由质量为113、114、115、116、117、118、119 和 121 的 报 道 基 团 （reporter group），质量为192、191、190、189、188、187、186和184的平衡基团（balance group）和1个相同的肽反应基团（reactive group）组成。一般过程是将样品经胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段后与iTRAQ试剂多重标签进行差异标记，使试剂的肽反应基团与样品肽段的N端及赖氨酸侧链连接，标记所有酶解肽段。将标记样本相混合，最后用液相色谱－串联质谱联用技术（LC－MS／MS）进行分析。由于平衡部分保证iTRAQ试剂标记的同一肽段的质荷比相同，因此不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测时质荷比完全相同，而在串联质谱中，标记肽段裂解，使平衡基团在二级质谱发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比（113～121）的峰，根据波峰的高度及面积，通过生物信息学的工具和分析方法得到蛋白质的定量信息。

5.2 iTRAQ技术的特点及应用

该技术作为一项新的蛋白质研究技术，在应用中具有以下优点：①可同时对8种或4种样本进行定量比较，省时省力；②能够标记样本中几乎所有的蛋白质，包括DIGE技术不能检测的膜蛋白、疏水蛋白等及翻译后修饰的蛋白；③报告离子为小分子物质，能保证定量的准确性。但其缺点在于iTRAQ试剂也容易与样本中的杂质蛋白及样本处理中缓冲液的污染蛋白结合，因此需要对样本进行预处理，尽量减少污染。另外，iTRAQ试剂非常昂贵［20］。

目前，iTRAQ技术以其独特的优势在蛋白质组学定量研究中得到了广泛的应用。在微生物研究中，Manavalan A等［21］使用iTRAQ技术研究了白腐菌生长于纤维素、木质素及其两者混合物中时分泌蛋白酶的不同，为木质纤维素生物能源的利用提供了理论基础；在关于分子机制的相关研究中，Ferret－Bernard S等［22］分别分析了未成熟、促Th1分化和促Th2分化的DC细胞膜表面蛋白的变化，为DC细胞促进Th1和Th2分化的机制提供了新的见解；同时，该技术也更多地运用在了生物标志蛋白的发现研究中，揭示了各类疾病潜在的致病机理［23－25］。

iTRAQ作为一种新型的蛋白组学技术，完美的将非凝胶串联质谱技术与同位素标记技术相结合，实现了对多种不同样本同时进行定量分析的愿景。国内外多项研究表明，iTRAQ具有较好的定量效果和良好的重复性。随着该技术的深入开展及质谱技术、软件分析系统的改进，iTRAQ必将成为定量蛋白组学的支撑技术。

6 小结

蛋白质组学研究的重要性使其相关技术得到了突飞猛进的发展。其中，双向电泳作为分离分析蛋白质的重要手段，在蛋白质组研究中发挥了关键作用，但基于质谱的iTRAQ技术很好的解决了双向电泳在极端蛋白分离、自动化高通量等方面的弊端，成为蛋白组学研究的主要工具之一。免疫共沉淀、酵母双杂交及蛋白质芯片等研究蛋白质相互作用的方法在试验中各有其优缺点，但容易出现假阳性和假阴性的结果，所以同时选择两种以上的研究方法进行研究结果的验证是十分必要的。总之，这些技术被广泛地应用在各个科学领域，并通过现有研究方法和技术的改进、不同方法和技术的结合使用及新技术的发明不断完善生命活动中的蛋白质时空互作网络，为生命科学研究带来了更多的成果［26］。

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