细菌λRed重组技术的应用及其影响因素

付喜爱，张德显，周 维，于立辉，田春莲，刘明春

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866）

同源重组是指发生在姐妹染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，常用于基因敲除或者置换。目前，同源重组中以λRed同源重组系统在细菌中应用最广。Red同源重组系统是由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta（β）和 Gam（γ）蛋白组成。γ蛋白抑制内源性RecBCD和SbcCD核酸酶作用［1］，从而保护导入的DNA链免于降解；Exo蛋白能从5′端到3′端降解双链DNA（dsDNA）中一条链，留下全长的一条单链 DNA（ssDNA）［2－3］；β蛋白与ssDNA结合并催化其退火，在复制叉出与新合成的链结合作为冈崎片段的一部分［2－3］，形成重组体。dsDNAλRed重组过程与寡核苷酸重组过程一样［4］。Ellis H M 等［5］研究表明，λ噬菌体上的exo缺失对ssDNA重组的效率没有影响，gam缺失重组率大约降低为原来的1／5，说明ssDNAλRed重组中只有beta是必不可少的。Mosberg J A等［2］研究支持全长的ssDNA作为重组中间体，有助于阐明内源性核酸酶如何作用于重组的ssDNA和dsDNA，为λRed重组机制提供了新的见解，对正确应用重组技术就有指导意义。

λRed重组系统是大肠埃希菌靶基因置换的有效技术，为染色体DNA、质粒或BAC上靶基因整合、删除和点突变提供了简单而有效的方法［2］。利用λRed重组技术不仅可以构建工程菌，还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。据报道有许多因素可影响重组频率，如底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等［6－9］。论文综述了λRed重组技术的研究进展及影响重组的因素，以期为优化重组试验方案及提高重组效率提供帮助。

1 λRed同源重组技术的应用

λRed同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40bp～60bp同源序列的PCR产物或合成的寡核苷酸片段，通过电转化导入宿主菌细胞内，在λ噬菌体编码的Red重组酶的作用下，使导入细胞内的线性DNA片段与染色体或载体的特定靶序列进行高效的同源重组，将靶基因置换下来。λRed同源重组系统是细菌基因敲除的有力技术，基因的缺失或置换是确定基因的未知功能、阐明致病机理的重要手段。利用λRed同源重组系统进行基因敲除在细菌中尤其是大肠埃希菌中的应用最为广泛。

1.1 构建工程菌，提高代谢产物的产量

λRed同源重组系统在细菌中非常重要的应用就是构建工程菌。其主要目的是通过敲除细菌中的某个基因，改变细菌的代谢途径，提高人类所需代谢产物的产量。赵志军等［10］利用λRed同源重组技术在敲除大肠埃希菌的mtr基因的基础上，构建mtr.tnaB和mtr.aroP双基因敲除菌，从而提高色氨酸的产量。陈欣等［11］利用λRed同源重组系统敲除一株可高效合成氨基葡萄糖GlcN和其乙酰化衍生物N－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的重组大肠埃希菌Escherichiacoli－glms－gna1的nagE和 manX，获得单基因敲除工程菌E.coli－glms－gna1－ΔnagE和nagE／manX双基因敲除的工程菌E.coli－glmsgna1－ΔnagE－ΔmanX，这两株工程菌GlcN的最大产量分别是对照菌株的1.08倍和1.20倍，GlcNAc的最大产量分别是对照菌的1.7倍和2.86倍，对GlcN的工业化生产具有指导意义。郭媛等［12］利用λRed同源重组技术敲除大肠埃希菌BW25113的pflB、frdAB、fnr、AdhE基因，成功构建四基因敲除菌株，使得异丁醇的产量增加了40%。

众所周知，L－色氨酸作为人和动物的必需氨基酸，已广泛应用于医药、食品和饲料工业；氨基葡萄糖广泛应用于保健食品和医药领域，氨基葡萄糖及其相关产品在国内市场有巨大的开发空间和潜力；与乙醇相比，异丁醇具有物理性质稳定、运输方便、生产耗能较少的优点，将来极有可能代替乙醇作为车用燃料。因此可以看出，利用λRed同源重组技术构建工程菌，将会给人类和社会带来巨大的经济价值。

1.2 探究细菌的致病机理

细菌致病的机理往往是多个因素相互作用的结果，很难确定某一因素对细菌致病性的影响程度。利用λRed同源重组技术敲除细菌中的某个基因，比较基因敲除前后菌株致病性的变化，从而有助于阐明致病机理。王海光等［13］利用λRed同源重组技术敲除大肠埃希菌O157∶H7的ompA基因，细胞试验表明外膜蛋白A基因敲除菌株的黏附力下降，对阐明大肠埃希菌O157∶H7的致病机制具有重要的意义。HPI毒力岛是大肠埃希菌的重要毒力因子，其中irp2基因为铁调节蛋白［14］，与细菌的致病性有密切的关系［15］。李叶芳等［16］利用λRed同源重组技术成功敲除禽致病性大肠埃希菌HPI毒力岛irp2基因，为深入探究该基因在禽致病性大肠埃希菌治病过程中所发挥的作用打下基础。余华等［17］利用λRed同源重组技术成功敲除铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因Pa，将为系统深入的研究弹性蛋白酶在该菌致病性中的详细作用机理提供材料和基础。李保利［18］应用λRed重组系统分别构建肠炎沙门菌C50041crp、spiC单基因缺失菌株和双基因缺失菌株，细胞侵袭实验表明，这3株缺失菌与野生菌株相比对细胞的侵袭力明显降低。由此可见λRed同源重组系统是探究细菌致病机理的一种重要方法，为致病机制的阐明做出突出的贡献，同时也为弱毒疫苗的生产奠定基础。

1.3 研究细菌的耐药机制

随着抗菌药物的不合理使用，耐药菌株的产生日益增加。对耐药菌株的耐药机制的研究已成为热点。λRed同源重组技术为耐药机制的研究提供了新的思路。Wu X等［19］利用λRed同源重组技术敲除大肠埃希菌的ompW基因，药敏试验结果显示基因敲除菌株对硫酸新霉素和氨苄青霉素的敏感性大大提高，从而说明ompW基因在细菌抗性方面起着关键的作用。孟春萍［20］采用λRed同源重组技术成功构建鸭大肠埃希菌标准菌株主动外排基因acrB基因缺失菌株，敲除acrB基因后菌株对庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等5种药物的敏感性较原菌株明显升高，表明acrB基因在主动外排中有重要作用。陈彩杰［21］应用λRed同源重组技术成功构建鸭大肠埃希菌标准菌株主动外排调控基因marA基因缺失菌株，药敏试验结果显示庆大霉素、头孢噻呋、恩诺沙星、多西环素对marA基因缺失菌株的MIC值较原菌株的显著下降；并且通过荧光定量PCR方法检测到marA基因缺失菌株的各主动外排基因的mRNA的相对表达量均有所下降，表明marA基因对鸭大肠埃希菌多重耐药具有一定的调节作用。由此可见，通过λ Red同源重组技术可以明确某基因在耐药方面所起到的作用，有助于阐明耐药机制，为新药的合成提供理论平台。

1.4 其他方面

何彰华等［22］利用λRed同源重组技术成功构建了一种四环素抗性表达载体pET－mt28a（＋），并可介导多基因的协同表达。牛小羽等［23］使用λRed同源重组技术构建弗氏志贺菌2aphoN1基因缺失菌株，初步探究phoN1基因在该菌中的作用。Hu S B等［24］研究发现，λRed同源重组系统为研究根癌土壤杆菌基因功能组学和改良菌株提供了简便而快速的方法。总之，λRed同源重组技术推动了细菌基因功能组学的研究。

2 影响λRed同源重组的因素

λRed同源重组的应用往往因重组频率而受到限制。研究人员发现，许多因素可影响重组频率，如底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。深入了解影响同源重组的影响因素，对提高重组频率，拓宽λRed同源重组技术的应用具有重要意义。

2.1 底物和目的片段

细菌常以线性打靶片段dsDNA或ssDNA为底物进行λRed同源重组。线性打靶片段的构成相同，中间常为用于选择的标记基因片段，两侧为靶基因上下游的同源片段。

2.1.1 线性 DNA 的浓度 Yu D等［6］研究发现，在大肠埃希菌中，只需要较低浓度（300ng）的线性dsDNA，λRed重组就能达到最大重组频率；当浓度继续增加，甚至远远超出此浓度时，重组频率不但不升高反而降低。而当ssDNA的浓度相对较高（5μg）时，重组的频率达到最大。

2.1.2 同源片段的长度 在大肠埃希菌中，同源片段长度为40bp的线性dsDNA能足够有效的进行λRed重组；当同源片段长度从40bp增加到1 000bp时，重组频率只增加了10倍；而当同源片段的长度低于40bp时，重组频率呈指数下降［6］。Mythili E等［25］研究表明，β蛋白能与36nt DNA链稳定结合，不能与长度小于36nt DNA链结合。同源片段的长度可能影响其与互补片段的有效识别和配对。如果这个猜测成立的话，那么同源片段的长度也影响β蛋白与同源片段分离，进而影响着β蛋白释放链的3′端和链的强配对。因此，如果同源片段太短，以至于不能与靶片段有效的配对，导致β蛋白仍然结合在链的3′端，就不能发生重组。

2.1.3 链偏差 Ellis H M 等［5］研究发现，ssDNA λRed重组中非模板链的重组频率大约是其相应模板链的5倍，这样的链偏差在dsDNAλRed重组中不存在。通过检测发现链偏差与DNA的复制方向相关。复制叉在原点向两个方向延伸，使得寡核苷酸更容易与后随链的相应区域进行重组。DNA复制方向导致链偏差说明ssDNA重组可能发生在复制叉附近。复制过程中ssDNA出现瞬态区域，与β蛋白结合催化其退火。后随链重组频率的增加可能反映了在以前导链为模板合成后随链时，单链区域数量增加，DNA聚合酶和DNA连接酶完全可以将退火链连接到染色体上。虽然链偏差程度和重组体绝对数量有相当大的差异，但是链偏差反映了染色体区域结构和重组率的变化。Costantino N等［7］研究发现，去除MutS蛋白的菌株中仍存在链偏差现象，说明寡核苷酸序列和错配修复过程与链偏差不相关。在mutS基因敲除菌株中链偏差对重组频率的影响表现的更加明显［26］。

2.2 错配蛋白

细菌中许多蛋白参与复制叉的前进。甲基导向错配修复（methyl－directed mismatch repair，MMR）系统能校对复制。MMR系统中的MutS蛋白结合DNA链与系统中其他的功能蛋白一起修复单一碱基对错配或者能清除1个～3个核苷酸的插入。宿主菌中的MMR系统能纠正复制出现的碱基错配，发现后立即切除错误的碱基。ssDNA在DNA复制叉附近重组产生单碱基突变可能会触发错配修复，因而影响重组的结果。相同条件下，缺失MutS蛋白的细菌λRed重组的频率至少提高100倍，接近1／4的活细胞中出现碱基突变［7］。清除MutS蛋白的研究使得遗传修饰更加有效，并且能允许核苷酸类似物和加合物与染色体结合进行体内生化研究。

2.3 内源性核酸酶

尽管硫代磷酸（phosphorothioate，PT）键能阻碍λExo作用，但是5′端硫代磷酸化的dsDNA仍容易发生重组，这一谜团直到 Mosberg J A等［8］研究首次确定ExoVⅡ（核酸外切酶）是降解ssDNA和dsDNA末端的核酸酶时才得以解。两端硫代磷酸化的dsDNA转入细菌，ExoVⅡ降解一条或两条链的5′端PT键产生与其结合的ssDNA末端。在ExoVⅡ作用后，λExo降解dsDNA的前导链，留下后随链作为重组的中间体，完成这一步还需要解旋酶和其它内源性核酸酶的作用。此外，还发现dsDNA在不同核酸酶基因敲除菌株中的重组频率各不相同［8］，说明内源性核酸酶和重组基因之间密切相关，改变内源性核酸酶的活性可能严重影响λRed重组，为进一步提高dsDNA重组频率提供了有价值的策略。

Dutra B E等［9］研究发现，大肠埃希菌中ssDNA核酸外切酶（ExoⅠ和ExoVⅡ）能抑制重组，在多个ssDNA核酸外切酶缺失菌株中，重组频率显著增高。清除ExoVⅡ不仅可提高重组频率，同时还能提高ssDNA和dsDNA 3′末端突变的遗传。进一步研究发现，清除一系列的5个核酸外切酶（RecJ、ExoⅠ、ExoVⅡ、ExoⅩ和λExo）可显著提高λRed联合选择多元自动化基因组工程（CoSMAGE）的操作，促进重组多样性的产生和更多的同时突变的形成［8］。Gregg C J等［27］研究发现应用双选标记tolC能促进CoS－MAGE的循环稳定、持续，产生100%完全的基因置换，而不需要任何的间歇筛选或直接选择。

2.4 其他因素

除了上述因素外，还存在其它的因素影响重组的效率，如λ噬菌体上pL启动子诱导时间。pL启动子由温度敏感型λcⅠ阻遏因子控制，42℃时λcⅠ失活，诱导pL启动子表达。当诱导时间为7.5min时，重组效率最大；诱导时间在7.5min～17.5min的范围内，能维持最大重组水平；当诱导时间长于17.5min时，重组水平降低，当pL启动子的表达时间大于60min时，能导致细菌死亡［6］。另外，加入非特异性载体DNA能增强大肠埃希菌中λRed重组频率［28］，这可能是因为载体妨碍内源性核酸酶降解底物。但这种现象只在用于重组的寡核苷酸浓度较低时检测到。敲除内源性核酸酶基因的宿主菌，增加载体的数量不能使重组频率增加。λRed重组中，非靶位点整合也影响重组频率。Mosberg J A等［2］指出这可能是由于底物和基因组上非靶位点之间的微观同源性导致错误定位，但是影响错误定位的因素还不确定。

3 小结

λRed同源重组系统是同源重组中发展最为成熟、应用最为广泛的体内遗传工程研究技术，能任意的插入或删除DNA片段而不用考虑限制性酶切位点的问题。但是在一些应用中因重组频率而受到限制。全面深入的了解影响λRed同源重组的因素，必将为细菌基因重组试验方案的优化、改善重组工程的操作和深入研究重组机制提供理论依据。随着研究的不断深入，λRed重组技术必将应用于更广泛的细菌乃至生物体中，从而推动功能基因组学的研究。

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