Toll样受体信号转导的负调控机制研究进展

高 明,敖 越,栾新红*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161；2.沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110034)

Toll样受体信号转导的负调控机制研究进展

高 明1,敖 越2,栾新红1*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161；2.沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110034)

Toll样受体(TLRs)为模式识别受体的一员，是介导天然免疫及病原体信号转导与细胞活化信号转导的重要跨膜信号传递受体。研究发现许多负向调节蛋白通过靶向TLRs信号通路的关键信号分子，干扰信号转导途径中连接复合体形成、泛素化降解信号通路中接头蛋白、转录调控等不同方式负向调控TLRs信号通路，及时抑制TLRs信号，维持机体的免疫平衡。论文就TLRs信号转导途径及其负调控机制进行了综述。

Toll样受体；免疫；负向调控；信号转导

Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)的一员，是介导天然免疫及病原体信号转导与细胞活化信号转导的重要跨膜信号传递受体，可识别高度保守的微生物组分——病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns，PAMPS)。TLRs属于跨膜蛋白，包括胞膜外区、胞浆区和跨膜区3个部分。其中，胞膜外区包含有17个～31个富含亮氨酸的重复序列(leucine rich repeats，LRRs)，其间有非LRR序列分隔，LRR基序一般由24个氨基酸组成，主要是有利于促进蛋白质间的相互黏附，参与识别PAMPS，胞浆区结构域与IL-1受体家族高度相似，故被称作Toll/IL-1受体(Toll/interleukin-receptor，TIR)结构域，在所有的Toll样受体中，TIR结构域高度保守。TLRs分布非常广泛，在B淋巴细胞、NK细胞、单核-巨噬细胞及树突状细胞表面都有分布，主要在天然免疫系统的细胞上表达。迄今为止，已经发现至少15种TLRs，鼠类和人类的TLR1-9相同，TLR10为人类特有，TLR11-13为鼠类特有， TLR14 和 TLR15是相继在小鼠和鸡体内发现的，也有报道称在小鼠和人体内均有TLR14的表达。

1 TLRs信号转导途径

TLRs信号通路的活化在机体完成各种生命活动的过程中发挥着重要的作用。由TLRs介导的信号转导通路可以诱导很多反应的快速活化，产生如一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎症细胞因子、共刺激分子、趋化细胞因子等效应分子，激活炎症反应，参与机体防御反应。所有TLRs家族成员均依赖于TIR结构域向细胞内转导识别信号，与接头蛋白结合，活化核转录因子NF-κB、丝裂原蛋白激酶(MAPK)p38、IFN诱导因子等转录因子，最终诱导靶基因表达[1]。目前已经发现了至少有5种不同的转接蛋白参与了TLR信号途径，即髓样分化分子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)、MyD88-转接体样/TIR-相关蛋白(MyD88-adaptor-like/TIR-associated protein，MAL/TIRAP)、Toll受体相关分子(Toll-receptor-associated molecule, TRAM)、诱导IFN-β的含TIR 结构域转接体(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)和SARM (sterile a and HEAT/Aimadillo motifs)。其中，MyD88和TRIF可以诱导下游激酶活化从而引起一系列级联反应，而TRAM和MAL/TIRAP可以分别转运MyD88和TRIF激活TLRs，接头蛋白SARM 则与TLRs信号通路的负调节有关。根据接头蛋白的不同，可以将TLRs的后续信号转导途径分为MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径两种。TLR5、7、8和9与配体识别后直接与MyD88相互作用，而TLR4和TLR2(与TLR1或TLR6形成二聚体)则需首先结合桥梁接头蛋白Mal，再募集MyD88。值得注意的是，TLR4不能直接识别LPS(lipopolysaccharide，TLR4配体)，需要 CD14锚定分子，增强LPS与TLR4的附属蛋白MD2分子的结合，然后再结合细胞表面的TLR4，从而形成稳定的受体复合物。MyD88被募集到活化的TLRs后，结合IRAKs，IRAKs再活化TRAF6，进而活化TAK1。活化的TAK1磷酸化IKK复合物。IKK复合物再磷酸化IκB，IκB降解，NF-κB转位至细胞核，诱导促炎细胞因子的表达。在浆细胞样树突状细胞(pDC)、TLR7、TLR8和TLR9的活化，能导致IRF-7的活化和核转位，最终使IFN-α表达。MyD88非依赖途径仅仅被TLR3和结合TRIF的TLR4及TLR5利用；TRIF活化己结合IKKi的TBK1，调节IRF-3的活化和核转位，最终使IFN-β表达；经由MyD88非依赖途径的TLR4信号要求一个桥梁接头分子TRAM，经由TRIF活化TRAF6导致NF-κB活化，而TLR5则直接募集TRIF，经TRAF6活化NF-κB[2]。

TLRs通过刺激先天性免疫应答和提高获得性免疫反应来保护机体，但是它所引起的持续性炎症反应也会对机体产生损伤，进而引起内毒素性休克、自身免疫性疾病、心肌损伤及2型糖尿病等病症发展和恶化，还会促进肿瘤特别是炎症相关性肿瘤的发生、转移和免疫逃逸[3]。因此，TLRs信号通路的活化必须受到严密的控制并需要相应的负向调控机制以使机体处于一个相对稳定的状态，本文主要介绍TLRs负调控的研究进展。

2 TLRs信号转导负调控机制

2.1 干扰信号转导途径中连接复合体形成

TLRs传递信号需要与胞内的接头分子连接形成复合体，含有TIR结构域的接头蛋白发生变化阻碍了TLRs连接复合体的形成，阻断下游信号转导通路。TRAM的一种变异体TAG(TRAM adaptor with GOLD domain)和TRAM竞争与TRIF结合而抑制TRIF转导通路[4]。TAG存在于晚期内涵体。研究表明，TAG被运送到溶酶体，诱导TLR4分解同时抑制TRIF转导通路。TRIF、MyD88是TLRs信号激活的接头蛋白，诱导下游激酶活化从而引起一系列级联反应，含有TIR结构域接头蛋白SARM，在LPS刺激下通过直接结合TRIF可以阻止TRIF复合物的形成，抑制TRIF依赖途径，但抑制的分子机制有待阐明。

IRF5直接与MyD88作用诱导系列TLR诱导基因。TLRs活化诱导IRF4和IRF5竞争与MyD88结合，导致IRF5基因诱导阻断[5]。IRF4基因缺陷小鼠对DNA诱导的刺激敏感，同时伴随细胞因子增加。肿瘤坏死因子α-诱导蛋白8(TNFAIP8)，TNFAIP 8L2(又称TIPE2)结合 caspase 8调节激活蛋白(AP)-1和NF-κB活化。caspase 8通过TLR在免疫细胞的活化及调节细胞凋亡起着重要作用[6]。TIPE2基因缺陷小鼠对TLR配体刺激敏感，表明TIPE2负调控TLR信号转导。

某些Nod样受体(NLRs)作为细胞内PRRs，与炎症发生有关。NOD样受体(NLR)家族成员X1(NLRX1)，通过与TRAF6和IKK复合物作用抑制TLR信号[7]。LPS刺激后NLRX1经K63链多聚泛素化与 TRAF6解离，再通过富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域结合到IKKβ激活激酶结构域。NLRX1基因敲除小鼠NF-κB过度活化，炎性细胞因子升高，易患感染性休克，这表明NLRX1是体内的TLRs信号负调节因子。另一个NLR蛋白-NLRC5，通过抑制IKK负调控TLR信号通路。然而，NLRC5基因缺陷小鼠在抵抗细菌和病毒感染方面反应表现正常。这些蛋白质的生物学意义有待进一步研究。

翻译后修饰，如磷酸化和泛素化，通过调节接头蛋白在信号转导中发挥重要作用。TRAF6泛素化使NF-κB活化，TANK缺陷细胞TRAF6泛素化增强，这表明TANK与TRAF6结合并抑制其泛素化[8]。SHP(small heterodimer partner，SHP)通过抑制TRAF6泛素化负向调控TLR信号[9]。经LPS处理后SHP缺陷细胞表现出肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β和IL-6表达升高。

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活有丝分裂与应激活化蛋白激酶(MSK) 1和2引起级联反应限制TLR4信号转导的炎症影响[10]。在LPS刺激下MSK1和MSK2缺失限制磷酸化转录因子CREB (cAMP responsive element binding protein 1)和激活转录因子1 (ATF1)与抗炎细胞因子IL-10启动子结合。

TGF-β激酶(TAK1)是一个重要的激活MAPK和NF-κB信号通路的激酶。在髓系细胞中TAK1正向调节NF-κB和MAPK表达。然而在中性粒细胞，TAK1缺陷加强p38磷酸化及细胞因子和活性氧的产生(ROS)[11]。髓系特异性TAK1基因缺陷小鼠显示脾肿大和淋巴结肿大，易感LPS诱导的脓毒性休克，表明TAK1负调控p38活性。

Tollip (Toll interacting protein，Tollip)与TLR4/MyD88/IRAK复合物作用，抑制LPS所致的IRAK的磷酸化激活，减少NF-κB的转录活性，从而抑制炎症的发生，Tollip的表达下降或功能异常促进了某些慢性炎症性疾病的发生及发展。研究表明在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠肠上皮细胞低表达TLR4而高表达Tollip，它可降低IRAK磷酸化而对肠道细菌产物表现出低反应性，从而避免肠道内细菌源性的TLR配体诱导过度炎症反应[12]。

体外用TLR2、TLR3和TLR9配体刺激后，A20基因缺陷小鼠显示多器官炎症，巨噬细胞产生炎症因子的水平显著增加。A20是一种去泛素化酶，它能够阻断TRAF-6与多聚泛素链的连接，抑制NF-κB核转位。此外，A20具有E3连接酶活性，通过TAK1抑制IKK活化，这表明A20通过多种机制调节NF-κB激活[13]。

泛素特异性蛋白酶4(USP4)解离TRAF6上的多聚泛素链，与TRAF6结合抑制IL-1β诱导NF-κB活化[14]。LPS刺激后USP4缺陷鼠细胞因子表达增多。DUBA(去泛素化酶A)是Ⅰ型IFN产生负调控因子，DUBA选择性结合和切断连接TRAF3上的K63多聚泛素链抑制TLR诱导的Ⅰ型IFN的产生但不影响NF-κB的活化。

2.2 泛素化降解信号通路接头蛋白

泛素化参与翻译后修饰机制和调节多种细胞活动,包括基因转录、细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长、炎症过程等。E3泛素连接酶( E3 ubiquitin ligase)是一种具有调节目的蛋白泛素化水平的分子，通常以K48偶联的泛素化方式促进目的蛋白通过蛋白酶体系统降解，E3泛素连接酶可以通过调节TLRs通路中的多个信号分子的降解从而调节免疫应答。

E3连接酶TRIP(TRAF interacting protein，TRIP)通过降解TBK1负向调控IFN-β的产生[15]。TBK1是TLRs下游的一种非常重要的磷酸激酶，TBK1磷酸酶活性的高低直接决定了下游转录因子IRF3的磷酸化水平及活性。研究结果显示TRIP可以与TBK1发生结合，进而对其进行K48位泛素化，并最终使TBK1发生泛素-蛋白酶体途径的降解，TBK1含量降低，其对IRF3的磷酸化能力就会降低，进而影响了IFN-β的产生。E3泛素连接酶家族蛋白细胞因子信号抑制物(SOCS)能够泛素化降解TIRAP/MyD88接头蛋白相似物和TRAF蛋白[16]。TLR配体处理组小鼠与对照组相比，TAM(Tyro3，Axl，和Mer)受体酪氨酸激酶(RTK)缺陷的树突状细胞(DCs)炎性细胞因子的表达水平升高，用TAM受体配体刺激DCs能抑制TLR诱导细胞因子的产生。进一步的分析表明，TAM受体信号通路通过(STAT)1上调SOCS1和SOCS3表达，SOCS1能够泛素化降解Mal，而SOCS3则可以泛素化降解TRAF，从而抑制TLR诱导的细胞因子产生。E3连接酶WWP2 ( WW domain-containing protein 2)通过促进TRIF发生K48位泛素化降解，进而抑制TLR3介导的天然免疫应答[17]。

TRAF蛋白是TNF受体及TLR-IL-1R介导的信号通路中重要的接头蛋白分子，下游促进细胞因子分泌，启动天然免疫应答。F-box蛋白家族的两个成员，Fbxl2及Fbxo3能相互拮抗，调控TRAF介导的炎症反应[18]。Fbxl2能够通过泛素化降解TRAF从而抑制炎症反应；Fbxo3又通过泛素化降解Fbxl2来增强促炎因子的释放。F-box家族作为SKP1-CUL1-F-box protein ( SCF) E3连接酶复合物的组成蛋白，负责特异性识别泛素化底物。在小鼠肺上皮细胞(mouse lung epithelial cell ,MLE)中Fbxl2能够泛素化TRAF1-6，并降低TRAF的表达;在巨噬细胞系U937中敲低Fbxl2，发现TRAF表达水平增高，LPS诱导的促炎因子释放增加。表明Fbxl2通过泛素化TRAF并介导其降解来抑制炎症反应。Fbxl2能够被GSK3β ( glycogen synthase kinase 3β)磷酸化，进而能够被Fbxo3识别和泛素化，最终导致Fbxl2的降解。在MLE与U937细胞系中敲低Fbxo3，使Fbxl2的稳定性增强，TRAF1-6的表达水平降低。

β2整合素和Fcγ受体诱导钙信号导致IL-10上调和抑制参与先天性免疫的信号分子，从而间接抑制TLR信号。此外，整合素(CD11b)激活Syk(spleen tyrosine kinase)，Syk磷酸化MyD88和TRIF并将这些蛋白与Cbl-b(Casitas B-lineage lymphoma)结合，通过泛素-蛋白酶系统促进其降解[19]。

iIκBβ是TLR信号活化过程的另一个关键信号蛋白。胞浆内iIκBβ发生磷酸化降解后释放p65入核，而新合成的iIκBβ入核形成IκBβ/p65/cRel复合物，促进NF-κB活化。E3泛素连接酶ARIH2特异性促进TLRs诱发的树突状细胞中iIκBβ降解，抑制NF-κB p65活性，从而调控DC成熟活化，控制炎症反应及自身免疫性疾病的发生[20]。

PDZ和LIM结构域蛋白2(PDLIM2)，是Janus激酶(JAK/STAT)抑制剂，通过降解NF-κ B组分p65抑制了TLR信号[21]。PDLIM2促进连接在p65上的K48链多聚泛素化并将其和富含26 S蛋白酶体核早幼粒细胞瘤(promyelocytic leukemia，PML)阻隔。在TLR配体刺激后，PDLIM2基因缺陷细胞不能降解p65，导致促炎细胞因子增加。肿瘤抑制因子(CYLD)可以抑制由TLR2介导的炎症因子的产生。在TLR2信号通路中，肿瘤抑制因子能够泛素化降解TRAF6和TRAF7，抑制NF-κB和P38的活化[22]。

三模序蛋白30α(tripartite-motif protein 30α,Trim30α)是TRIM蛋白超家族成员，TLR配体诱导促进TAK1结合蛋白2( TAB2-TAB3-TAK1)信号复合物降解。使用化学抑制剂CH4CL和氯喹实验表明，降解是依赖于溶酶体而不是蛋白酶体。TABs表达下降抑制NF-κB激活并减少细胞因子的产生，使Trim30α转基因小鼠免受LPS诱导的内毒素休克。另一个TLR诱导的TRIM蛋白，TRIM38，能作为TLR信号转导的负调节因子[23]。TRIM38干扰TRAF6和促进K48多聚泛素链形成，导致TRAF6蛋白酶体降解。

IRF3和IRF7也受泛素化降解调控。肽脯氨酰异构酶Pin1促进活化的IRF3多聚泛素化和蛋白酶体降解，抑制Ⅰ型IFN产生和抗病毒反应。Pin1特异性结合磷酸化的IRF3，通过WW结构域与磷酸化的丝氨酸、苏氨酸及脯氨酸结合并催化底物构象变化。Pin1并不象E3泛素连接酶直接催化，但这种构象变化有利于IRF3泛素化降解。对比表明，在TLR7和TLR9信号通路中浆细胞样DCs(pDCs)的IRAK1由Pin1活化[24]。IRAK1活化导致Ⅰ型IFN的产生。因此，在pDCs，Pin1正调节Ⅰ型IFN产生。

除了泛素-蛋白酶体系统，自噬系统也是一个主要的降解系统并在宿主防御中起着重要的作用。Atg16L1(克罗恩病的风险等位基因)缺失，LPS刺激导致高水平的ROS，IL-1β，IL-18的产生。这些反应是通过TRIF依赖途径，表明Atg16L1负调控TRIF依赖途径导致caspase 1活化。研究表明，Atg16L1缺陷潘氏细胞在肠损伤后炎性基因表达增加[25]。

泛素-蛋白酶体和自噬系统介导的信号蛋白降解在负调控TLR转导信号中起重要作用。与连接复合物形成受阻不同，这些降解是不可逆的，表明这种机制在很大程度上有助于终止TLR信号。

2.3 转录调控

基因表达的表观遗传调控揭示了通过染色质结构控制炎症反应。环AMP依赖性转录因子(ATF3)招募组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)到促炎细胞因子基因启动子区，促进组蛋白去乙酰化[26]。在LPS刺激下，ATF3基因敲除小鼠巨噬细胞释放大量的IL-12p40、IL-6和TNF-α。

B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤3(B-cell CLL/lymphoma 3，Bcl-3)是IκB家族的一员[27]。在TLRs重复或长时间的刺激作用下可导致Bcl-3反应性降低，在LPS刺激下，Bcl-3基因缺陷巨噬细胞与DCs会比野生型细胞产生大量的细胞因子。在Bcl-3基因缺陷细胞，NF-κB亚单位p50在LPS刺激后泛素化降解明显增加，表明Bcl-3通过稳定p50(NF-κB的亚单位上DNA结合位点)抑制TLR反应持续时间。

LPS诱导核受体相关蛋白1(nuclear receptor related 1 protein，Nurr1)，招募p65及CoREST复合物并抑制转录[28]。小胶质细胞是中枢神经系统中髓系细胞并应对感染和组织损伤。Nurr1基因敲除的小胶质细胞中细胞因子表达显著增加，提示Nurr1能保护神经元通过小胶质细胞防止过度的炎症反应。

含有CCCH型锌指基序的RNA结合蛋白通过促进TLR靶基因mRNA的衰变负调控基因的表达。锌指蛋白与TNF-α mRNA 3′端非翻译区(UTR)富含Au的元件相结合，通过招募脱腺苷化酶促进腺苷酸化，导致mRNA降解。Zc3h12a(又称为regnase-1)与IL-6、IL-12p40 mRNA作用并降低其表达[29]。通过TLR配体刺激zc3h12a缺陷巨噬细胞，能比野生型细胞产生高水平的IL-6和IL-12p40。此外，zc3h12a基因缺陷小鼠抗体产生升高。因此，Zc3h12a负调节TLR诱导的免疫反应和防止自身免疫性疾病，Zc3h12a具有去泛素化酶活性，能从TRAF蛋白上解除泛素链。因此，Zc3h12a通过多种机制控制免疫反应。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类具有多重功能的非编码RNA，能够在转录后水平调控基因的表达。在TLR/NF-κB信号通路中，多种miRNA可对通路中的蛋白具有负性调控作用，包括TLR通路中的信号分子、NF-κB转录因子及细胞因子等。在TLRs下游，miR-145和miR-146a以TLR接头蛋白TRAF6和IRAK1为靶标，miR-146a/b通过与其3′UTR结合使其表达受抑制，导致下游的信号分子不能被激活或激活不足，发挥对TLR信号通路的负性调控作用；NF-κB的激活是TLR信号通路发挥作用的重要环节，MiR-155和miR-199以IKKs为靶标，调控NF-κB的活性。MiR-223以IKK-α为靶标，在巨噬细胞分化过程中miR-223下调，导致巨噬细胞中IKK-α表达增加，进而抑制细胞中NF-κB靶基因的表达，从而抑制巨噬细胞的过度活化；将miR-147的类似物转染小鼠巨噬细胞，用LPS刺激该细胞后产生的IL-6、TNF-α明显减少，而敲除miR-147基因后得到了与之相反的结果，表明miR-147能减弱TLR介导的炎症因子的产生[30]。

3 小结

TLRs信号通路的活化必须受到严密的控制并需要相应的负向调控机制以使机体处于一个相对稳定的状态，这种调控是复杂的、多层次的。正常情况下，机体中存在很多TLRs信号通路的负向调控因子，可以十分精准的对TLRs信号通路进行负向调节，适当的减弱TLRs的信号强度或直接终止TLRs的信号传导，避免强烈的免疫反应对机体的造成的损伤，维持免疫平衡。目前，大量关于TLRs介导的信号转导途径的上游及下游信号事件的研究方兴未艾。随着研究的深入，更好地理解每一个TLR、每一个TIR接头蛋白和发现更多的靶向TLRs通路的关键性信号分子、适配蛋白或转录因子以及它们在人类与动物疾病的免疫应答中的作用，将为预防、干预、治疗TLRs介导的疾病提供全新的策略和方案。

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Progress on Negative Regulatory Mechanism of Toll-like Receptor Signal Transduction

GAO Ming1,AO Yue2,LUAN Xin-hong1

(1.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUinversity,Shenyang,Liaoning,110161,China; 2.ShenyangAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Shenyang,Liaoning,110034,China)

This paper summarized the negative regulation of TLRs mediated inflammatory response pathway. The study found that many negative regulatory proteins negatively regulate TLRs signal pathway by different mechanisms (degradation and antagonist) targeting key signaling molecules, interfere with connection complex formation in signal transduction pathway, ubiquitination and degradation of adaptor protein in signaling pathway, transcription regulation, inhibit the TLRs signal and maintain immune homeostasis. The paper reviewed the transduction pathway of TLRs signal and its negative regulatory mechanism.

Toll-like receptor;immunity;negative regulation;signal transduction

2014-06-04

国家自然科学基金面上项目(31172286)

高 明(1970-)，男，辽宁阜新人，讲师，博士，主要从事基础兽医学研究。*

S852.1

:A

:1007-5038(2015)01-0096-06