非典型疯牛病研究进展

刘雨田，孙成友，迟田英，肖卫华，王志亮＊

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.江西省遂川县畜牧兽医局，江西遂川 343906）

牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy，BSE）又称疯牛病，是由朊病毒引起的牛的渐进性致死性传染病，与羊痒病、鹿慢性消耗性疾病以及人克－雅氏症等统称为传染性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathy，TSE）［1］。疯牛病为人畜共患病，病原主要通过消化道途径感染人。1986年，英国报道了全球第1例BSE，2年后英国查明BSE是由于牛饲用了污染痒病因子（即羊源性朊病毒）的肉骨粉而引起［2］。依据这个调查结果，各BSE发生国陆续实施反刍动物源性肉骨粉不得饲喂反刍动物以及剔除特定风险物质等综合防控措施，随后全球BSE病例数急剧下降，疫情得到很好控制，防控措施取得巨大成功。学术界在2003年以前普遍认为全球的BSE是由痒病因子（羊源性朊病毒）引起，因此乐观估计只要牛不饲喂动物源性饲料，全球消灭BSE指日可待。然而，在2003年，日本和意大利首次分别报道了1例和2例与典型BSE（C型BSE）不同但又类似的病例，称之为非典型BSE［3］。初步研究发现非典型BSE的致病因子虽然也是朊病毒，但与C型BSE的病原存在分子质量、糖基化、脑部分布等方面的差异［4－5］。此后，又有多个国家相继报道类似病例，并且有国家通过追溯查到早在2001年就已出现非典型BSE［6］。截止2013年底，全球的非典型BSE数量已超过60例，遍布十几个国家，但主要还是分布于本土BSE发生国。非典型BSE病例的不断发现引起世界各国和相关国际组织的高度关注，给全球BSE的防控又提出了新的挑战。本文对非典型BSE的特征和特点进行了概述，旨在提高人们对非典型BSE的认识，同时为完善我国BSE的防控工作提供理论支持。

1 基本特点

根据朊病毒的蛋白酶K抗性部分分子质量大小，非典型BSE可以分为H型BSE（朊病毒分子质量比C型BSE的较重）和L型BSE（朊病毒分子质量比C型BSE的较轻）。不管是黄牛品种，还是瘤牛品种，均发现了非典型BSE病例［7］。据目前有限的非典型BSE病例分析，发病牛平均年龄约为11岁，是C型BSE平均年龄的2倍［8］。H型和L型BSE的病例数比例大约呈1∶1的关系［4］。至于非典型BSE的基因突变问题，仅见报道美国H型BSE病例存在病毒第211号密码子的E／K突变性［9］，然而在其他H型BSE病例中未发现此位点的突变性［10］。针对非典型BSE，世界动物卫生组织专门召集相关专家进行过两次讨论，认为非典型BSE是一个变种，具有自发性散发性特点，发病率低，约为1／1 000 000～3／1 000 000，并且当前的BSE防控措施仍然有效，无需改变。基于以上观点，每个养牛国家均有可能会出现非典型BSE病例，只是能不能发现的问题。

2 临床症状与病理变化

非典型BSE没有特征性的临床症状。2007年，法国研究人员对35例非典型BSE的统计发现，18例为临床健康牛，其余17例为死牛或有病而急宰的牛，其中4头死牛在死亡前表现为倒地不起，3头急宰牛临床表现为C型BSE的神经性症状［8］。脑部接种H型BSE脑匀浆液的实验发现，接种牛9个月后表现出精神萎靡，异常低头，耳朵下垂，食欲下降，体况变差。随着病程发展，病牛离群，头抵住墙或门，连短暂的抬头也不情愿。病牛开始舔唇部，异常咀嚼（与进食无关），后期它们的频率和严重程度进一步加重，同时可见过度流涎［9］。在另一组脑内接种试验发现，H型和L型BSE发病牛的临床症状没有差别，均表现出与C型BSE相似的神经症状，如消沉、焦躁不安、惊恐、感觉过敏。此外，发病牛站立困难，步态异常，后肢过度伸展［11］。与C型BSE相似，非典型BSE也没有解剖病变。通过苏木精伊红染色，H型和L型BSE均可见中枢神经系统空泡变性。在脑闩部，C型BSE的空泡化明显比非典型BSE的严重。然而，在大脑部，非典型BSE（包括H型和L型）的空泡化比C型BSE的严重，尤其在额叶皮质［11］。也有接种试验发现，H型BSE在丘脑部核群和中脑部的空泡化最为严重，而在大脑皮层、小脑、基底核则呈中等程度的空泡化［10］。

3 病原在机体中的分布

脑内接种试验表明，非典型BSE的病原在脑部分布明显比C型BSE的要均匀，而且总体上L型BSE的脑部病原密度比H型BSE的要浓些［5］。H型BSE的病原广泛分布于脑部、脊髓和视网膜，少量分布于脑垂体神经部和三叉神经节，其中病原含量最多的部分是在脑干和丘脑，而小脑、嗅球、大脑皮层仅见少许病原［5，9］。H型BSE在下神经节、背根神经节、星状神经节、交感神经干、面神经、坐骨神经、视神经、副神经、臂神经丛、迷走神经、脊神经、马尾和肾上腺等神经组织也能检测到病原［10］。L型BSE的病原在脑干、基底核、嗅脑和丘脑含量最高，在大脑皮层和小脑部的含量次高，仅比脑干部（包括脑闩）的含量略低点［5，12］。研究还发现［13］，在临床前期，L型BSE感染牛的几个主要神经节（包括三叉神经节、颈部神经节、肠系膜神经节、星状神经节）、脑垂体、马尾（脊髓末端）、迷走神经和迷走交感干均可以检测到病原。在临床后期，肾上腺、前肢神经（包括肩胛上神经、臂神经丛、正中神经、桡神经）、坐骨神经、胫神经、膈神经和副神经也能检测到病原。然而，两种非典型BSE的淋巴组织均未发现病原［10］。

4 病原分子和生化特征

在温和工作浓度（50μL／mL）的蛋白酶K（proteinase K，PK）处理60min（37℃）后，用抗朊病毒核心片段单克隆抗体检测，发现L型BSE病原的双糖基化、单糖基化和无糖基化3条蛋白带的组成比例分别为39.3%±0.6%、35.0%±1.0%和26.3%±1.2%，分子质量大小分别为26.3ku±0.6ku、20.7ku±0.6ku和17.3ku±0.6ku，3条蛋白带的分子质量均比C型BSE病原的对应条带小1个ku左右。而H型BSE病原的双糖基化、单糖基化和无糖基化蛋白带的组成比例与C型BSE的类似，分别为58.3%±2.5%、29.3% ±0.6%和12.7% ±3.5%，分子质量大小分别为28.7ku±1.5ku、23.3ku±1.2ku和19.3ku±1.2ku，3条蛋白带的分子质量比C型BSE的对应条带均大1.5个ku左右［4］。因牛的个体差异、单抗的不同或PK酶处理的差异，其他研究结果与上述数据相比略有不同，但总体上一致［5，10］。将 PK 酶作用时间延长（工作浓度为50μL／mL）或将其工作浓度提高到250μL／mL及以上进行处理，检测发现C型BSE病原对PK酶的抵抗性最强，L型BSE的次之，H型BSE的最弱［4－5］。用 N－糖酰胺酶F（一种去糖基化酶）处理后，发现L型BSE的病原对该酶最敏感，糖基化的去除也最为完全，而H型BSE的次之，C型BSE的最不敏感。应用抗朊病毒C端抗体检测，还发现H型BSE多了一条10ku大小的条带，而L型和C型BSE的则没有［4，10］。试验表明，抗朊病毒N端抗体仅能检测到H型BSE的3条蛋白带，而对于C型和L型BSE，要么信号很弱，要么检测不到。用抗朊病毒核心片段或C端抗体则可以检测到所有类型BSE的3条蛋白带［4］。另外，H型和L型BSE的病原均能在脑部如大脑白质、基底核和丘脑等处形成淀粉样斑块［10］，而 C型 BSE没有这种特征［3］。

5 传染性

目前证实，人工条件下L型BSE病原可以感染家牛［14］、绵羊［15］、仓鼠［16］、猕猴［17］、狐猴［18］、野生型小鼠（第一代接种不发病，呈亚临床感染状态，第2代接种才感染发病）［19］、表达人朊蛋白［20］和牛朊蛋白［21］的转基因小鼠。而关于H型BSE的感染性试验报道较少，就现有资料表明，H型BSE病原可以感染家牛［14］、表达牛朊蛋白的转基因小鼠［21］、野生型小鼠（第一代接种就感染发病）［22］。在感染表达人朊蛋白转基因小鼠的实验发现，L型BSE的感染率比C型BSE的明显高，达到100%，而H型BSE不能使小鼠发病，感染率为0［20］。另一项研究发现，与C型BSE（平均潜伏期为230d）比较，L型BSE感染表达牛朊蛋白转基因小鼠的潜伏期明显缩短（平均潜伏期为185d），而H型BSE的潜伏期明显延长（平均潜伏期为330d）［21］。目前数据提示L型BSE比C型BSE具有更强的传染性。

6 诊断方法

不管是L型还是H型BSE，其病原在脑闩部的含量均较高，因此C型BSE的检测手段（采集脑闩部组织进行检测）也适合于非典型BSE。应用各种类型BSE的病料进行试验，比较目前常用的BSE快速筛检方法敏感性，发现Idexx HerdChek BSEScrapie短型方法具有最高的敏感性，其次是AJ Roboscreen BetaPrion方法、PrionScreen Check Western方法和Idexx HerdChek BSE－Scrapie超短型方法［23］。它们的敏感性均达到欧盟的相关要求。在非典型BSE确诊方面，一般应用免疫组织化学和免疫印迹方法，因此只要选用公认的针对朊病毒核心片段的单抗如6H4、P4、L42、F99等，就可以对非典型BSE做出确诊。

7 小结

几年来，在世界动物卫生组织（OIE）报告的BSE病例中，非典型BSE越来越多，C型BSE越来越少。这一现象说明，全球BSE疫情发生了质的变化，由过去的肉骨粉引起BSE疫情转变成自发性BSE病例。然而，非典型BSE与C型BSE一样具有较强的感染性，尤其是L型BSE，对多种动物均有较强致病性。因此，国际上对非典型BSE不敢一丝怠慢，仍然坚持严格的饲料禁令，美国更是在2009年加强了动物饲料禁令。另外，欧盟、北美等发生疯牛病的地区仍然严格执行以风险为基础的监测，强调重点监测临床疑似、死亡和紧急屠宰的牛，欧盟还对年龄大于72月龄的健康牛也进行监测。相信这些措施的继续实施，今后会有更多的非典型BSE病例出现，同时也将非典型BSE带来的新挑战化成不可怕的普通动物疫病事件。既然非典型BSE是一种老年牛的自发性疫病，那么不管哪个国家都应加强防范，努力防止人畜感染。目前，人们对非典型BSE的认识还非常有限，还不清楚它到底怎么来的、与什么因素相关、病原间的关系、病原在牛体内何时才出现等问题还需要解答。

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