中药诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展

邱淑敏，陈 涛，刘美玲，李龙飞，汉丽梅＊

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866）

细胞凋亡（cell apoptosis）是一个多因素参与的生理过程，涉及到免疫应答、基因调控、信号传导等多种过程［1］。细胞凋亡在多种正常生理过程中可起到调节作用，若此功能出现异常或缺失则可导致一系列病理情况发生。肿瘤细胞的特征之一就是缺乏这种程序性的死亡过程，而抗肿瘤中药可以诱导这种程序性死亡而达到治疗肿瘤的目的。英国科学家Hickman J A等［2］首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，随后诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗研究的新途径，也同样成为筛选抗癌药物的新靶点、新热点。学者们在中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究中，取得了较大进展，尤其是中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制方面的研究更加深入。研究发现中药可以通过调控原癌基因及抑癌基因的表达、影响细胞凋亡信号传导和阻滞肿瘤细胞生长周期等方面诱导肿瘤细胞凋亡。本文对近几年的有关中药单味药及中药复方诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究做一综述。

1 单味药及其有效成分诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究

1.1 对原癌基因及抑癌基因的调控

在肿瘤的发生发展中，凋亡相关基因起重要的调控作用，其中某些基因发生缺失、突变或过度表达，可导致细胞增殖失控或凋亡受阻。

野生型p53是抑癌基因，其编码蛋白的分子质量为53ku，通过对细胞生长的调控和促进细胞程序性死亡的发生而起抑癌作用。Bcl－2为凋亡抑制基因，根据Bcl－2的结构和功能可将Bcl－2基因家族分为两类，一类是抗凋亡基因，如Bcl－2、Bcl－xl、Bcl－w、Mcl－1；另一类是促进凋亡基因，如 Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。采用四甲基偶氮噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测番茄红素对人结肠癌细胞SW480的诱导凋亡情况，并应用反转录－聚合酶链式 反 应 （reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）检测 Bax和 Bcl－2基因表达情况，研究发现番茄红素下调人结肠癌细胞中Bcl－2基因的表达，上调Bax基因的表达，Bcl－2／Bax的比值下降，其通过调控原癌基因及抑癌基因的表达来诱导肿瘤细胞凋亡［3］。牛蒡子苷元对结肠癌细胞SW480凋亡的影响及相关机制研究中发现，牛蒡子苷元可诱导SW480细胞凋亡，其机制可能与抗凋亡基因Bcl－2和IAP－1表达下调、促凋亡基因Smac和Bax表达上调有关［4］。

Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，可抑制多种刺激因素诱导的凋亡，使细胞永生化，并有利于细胞的异常增殖和恶性转化，进而导致肿瘤的发生。应用 MTT法、RT－PCR和蛋白印迹法（Western blot）检测不同浓度苦参碱对人宫颈癌Hela细胞凋亡情况及survivin基因表达量的变化，研究显示苦参碱下调人宫颈癌Hela细胞survivin基因的表达，其诱导其细胞凋亡的机制与survivin基因表达被抑制有关［5］。研究发现厚朴酚能够诱导大肠癌细胞凋亡，在这一过程中，与凋亡相关的sur－vivin基因和野生型p53基因起到相反的调控作用［6］。

1.2 影响细胞凋亡通路的信号传导

1.2.1 内源性线粒体介导的细胞凋亡通路 研究发现在细胞凋亡早期可观察到线粒体膜电位下降，膜通透性转变孔（permeability transition pore，PTP）开放，导致线粒体内细胞色素C（cytochrome C）、凋亡诱导因子、钙离子等从线粒体释放入胞质，通过级联反应启动凋亡。

通过提高细胞内钙离子的浓度［7］和动员凋亡相关基因的迁移导致线粒体膜通透性增大，促进凋亡诱导因子释放，进而诱导细胞凋亡。

有研究发现，丹参提取物作用于神经母细胞瘤细胞SH－SY5Y后，细胞内活性氧水平下降，半胱氨酸蛋白酶－3（caspase－3）的表达下调，胞浆内细胞色素C，Bax／Bcl－2比值减小，表明丹参提取物可能是通过抑制氧化应激和激活线粒体依赖的凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡的［8］。半枝莲提取物作用于肝癌细胞H22后，经透射电子显微镜可观察到核碎裂和细胞膜皱缩，此时细胞色素C从线粒体释放到细胞浆，活化caspase－3，从而诱导肝癌细胞 H22凋亡［9］。应用原位末端标记法和免疫组化法检测到P53表达的变化与细胞凋亡呈现相同变化规律，表明P53与细胞凋亡密切相关［10］。Western blot结果显示，在1.0μmol／L～12.0μmol／L浓度范围内，新藤黄酸明显升高MGC－803细胞凋亡诱导基因P53的表达，降低线粒体膜电位，其机制可能与促进P53介导的线粒体途径依赖的细胞凋亡相关［11］。

1.2.2 外源性死亡受体介导的细胞凋亡通路 外源性死亡受体介导的细胞凋亡通路，起始于细胞外的死亡受体与死亡配体的结合。已知的死亡受体有TNFR－1／TNFR－2、Fas、DR3、DR4和 DR5，目前被大家所熟知是CD95（Fas或Apo－1）和TNFRs死亡受体，均属肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族，作用于细胞凋亡的信号传递途径。细胞外的死亡信号通过死亡区域（death domain，DD）、死亡影响区域和半胱氨酸蛋白酶（caspase）补充区域（CARD），使配体与相应死亡受体结合引起凋亡。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）诱导人肝癌细胞Hep3B凋亡过程中，细胞周期分析结果显示，NCTD作用于肿瘤细胞后，细胞被阻 滞 于 G2／M 期 或 G0／G1 期，caspase－8 和caspase－3活化，表明NCTD诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制是通过非p53依赖途径活化caspase－8和caspase－3，进而激活死亡受体通路 TRAIL／DR5［12］。

研究显示肿瘤细胞通过Fas的表达下调，逃避机体的免疫监视，发生免疫逃逸，最终肿瘤细胞恶性增殖，肿瘤发生。Dai X L等［13］研究显示，Fas在乳腺导管癌中的表达低于在正常组织中的表达。抗肿瘤中药通过诱导Fas／FasL凋亡途径，调控肿瘤细胞凋亡。通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测发现β－榄香烯对人肝癌细胞HepG2的凋亡具有积极作用，能诱导细胞HepG2的细胞周期阻滞在G2／M期，明显上调Fas和FasL的表达［14］。曲欣等［15］采用化学分离方法，从连翘中分离提取抗肿瘤活性成分LQ－4，探讨LQ－4体外对人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制和诱导凋亡作用，发现LQ－4作用HeLa细胞后，透射电镜观察可见典型凋亡细胞形态，促进caspase－8酶原活化，在43ku及18ku上均有表达，得出其机制可能与参与死亡受体途径的启动子caspase－8蛋白酶原裂解有关。

1.2.3 其他信号调节通路 研究发现，木犀草素可诱导CHOP、Grp78和Grp94表达，诱导eIF2α磷酸化和ATF6α的剪切，基因敲除CHOP或者应用内质网应激抑制剂苯基丁酸可减轻木犀草素诱导的肿瘤细胞凋亡［16］。体内外研究姜黄素对恶性胶质瘤细胞的作用，发现其可降低Sonic hedgehog（Shh）和胶质瘤相关癌基因同系物1（glioma－associated oncogene homolog 1，GLI－1）的表达水平，抑制 Shh－GLI1信号通路的活化，诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡［17］。丹参酮ⅡA（TanshinoneⅡA ）是从中药丹参中提取的活性成分，作用于非小肺癌细胞A549（non－small cell lung cancer，NSCLC）后，可抑制NSCLC的增殖并诱导其凋亡，除了通过激活caspase－9和caspase－3的线粒体途径诱导凋亡，还激活了JNK信号通路，这可能是丹参酮ⅡA诱导肿瘤细胞凋亡的又一重要机制［18］。研究发现中药温郁金的有效活性成分β－榄香烯，可以治疗胶质瘤，其机制是破坏Raf－1的构象稳定性，减弱RAS／RAF／MEK／ERK激酶家族的磷酸化，包括Raf－1和ERK以及下游的目标信号如Bcl－2，进而引起Raf－1和ERK信号通路的抑制失活，导致胶质瘤细胞的凋亡［19］。

1.3 阻滞肿瘤细胞增殖周期

目前已有的研究证实，多数抗肿瘤中药的活性成分均可以通过细胞毒作用杀死肿瘤细胞，主要的机制是通过阻滞肿瘤生长所必需的RNA、DNA及蛋白质的合成，使肿瘤细胞增殖周期的一个或几个环节受阻，最终导致肿瘤细胞死亡。

胡桃科植物胡桃未成熟外果皮（青皮）、树枝和树皮中含有胡桃醌化合物，有研究发现其含药血清对人肺癌细胞A549可能具有生长抑制作用，将细胞阻滞在S期，诱导细胞凋亡［20］。青蒿琥酯可以下调人表皮癌细胞A431细胞周期蛋白A1（cyclin A1）、细胞周期蛋白B（cyclin B）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶2（cyclin－dependent kinase 2，CDK2）和周期蛋白依赖性激酶4（cyclin－dependent kinase 4，CDK4），将细胞阻滞于 G0／G1期，最终致使肿瘤细胞凋亡［21］。从苦荞中提取出槲皮素，研究其对人胃癌细胞SGC－7901增殖、凋亡和细胞周期的影响，结果表明槲皮素可使G1期和S期细胞减少，G2／M期细胞增多，且细胞凋亡率明显增加，其抗肿瘤机制可能是通过阻断细胞增殖周期而达到诱导肿瘤细胞凋亡的目的［22］。

2 中药复方诱导肿瘤细胞凋亡与其机制的研究

中药复方在治疗肿瘤疾病时效果较好，其机制方面的研究更是成为热点。焦宁等［23］研究益气养阴方及其拆方对急性髓细胞白血病小鼠细胞凋亡及相关蛋白的影响，发现治疗组细胞凋亡率升高，淋巴结c－myc、survivin蛋白表达降低，表明益气养阴方通过降低c－myc、survivin蛋白表达，诱导白血病细胞凋亡，起到治疗作用。以HepG－2肝癌细胞为研究对象，探讨小柴胡汤含药血清对肝癌HepG－2细胞的影响，检测结果表明，10%小柴胡汤含药血清作用于HepG－2肝癌细胞28h后，凋亡率从6.78%上升至19.51%，细胞线粒体膜电位明显降低，小柴胡汤含药血清能够抑制HepG－2肝癌细胞增殖，促进其凋亡，线粒体途径参与了该过程［24］。周昕欣等［25］首次证明了加味四君子汤含药血清抑制B16恶性黑色素瘤细胞增殖，促进B16恶性黑色素瘤细胞凋亡，说明加味四君子汤可能通过抑制B16恶性黑色素瘤细胞增殖和促进其凋亡途径，发挥治疗恶性黑色素瘤作用。研究表明三物白散含药血清作用MGC－803细胞后，随着三物白散含药血清药物浓度的增加及作用时间的延长，细胞增殖率逐渐降低，细胞抑制率、凋亡率逐渐升高，survivin蛋白的表达相应的降低，三物白散含药血清能够抑制人胃癌MGC－803细胞增殖，对细胞有诱导凋亡作用，在凋亡过程中涉及survivin基因表达下降［26］。

3 结语

综上所述，抗肿瘤单味药及其有效成分、中药复方都是通过多种途径诱导细胞凋亡的，包括影响细胞信号转导、阻滞细胞周期、调控原癌基因和抑癌基因等，充分体现了中药抗肿瘤的多靶点作用。目前研究的热点是靶向凋亡通路相关蛋白或酶的表达或功能调控，通过干预、调节与细胞凋亡相关因子的表达，广泛开展中药靶向阻碍或活化细胞凋亡相关通路的研究。中药诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究虽有较大进展，但由于中药化学成分复杂，药理作用广泛，其诱导肿瘤细胞凋亡的机制是多个层面、多个环节、多个部位的，很难从单方面来进行准确定位，因此需要进行深入的研究。如何合理利用中药抗肿瘤的优势，使中药在肿瘤的治疗中发挥更加重要的作用仍是需要解决的问题。

［1］Kerr J F，Wyllie A H，Currie A R.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide－ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26（4）：239－257.

［2］Hickman J A.Apoptosis induced by anticancer drugs［J］.Cancer Metastasis Rev，1992，11（2）：121－139.

［3］Zhao Qi－hui，Qiu Qing－chao，Hu Bo.Mechanism of lycopene induced cell apoptosis on human colon cancer SW480cells［J］.Cancer Res Prevent Treat，2012，11（39）：1306－1310.

［4］张和平，王敬敏.牛蒡子苷元对结肠癌细胞SW480凋亡的影响及其机制［J］.结直肠肛门外科，2012，18（4）：230－233.

［5］陈立波.苦参碱对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡及Survivin基因表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（15）：225－238.

［6］Lai Ying－Jiun，Lin Chien－I，Wang Chia－Lin，et al.Expression of survivin and p53modulates honokiol－induced apoptosis in colorectalcancer cells［J］.J Cell Biochem，2014，6：1－37.

［7］徐欢成，郑明学，古少鹏，等.钙信号转导对细胞凋亡的影响［J］.动物医学进展，2013，34（1）：112－115.

［8］Yu Hui－min，Yao Li－hua，Zhou Hong－zu，et al.Neuroprotection against Aβ25－35－induced apoptosis bySalviamiltiorrhizaextract in SH－SY5Ycells［J］.Neurochem Int，2014，17：1－7.

［9］Dai Zhi－Jun，Wang Xi－Jing，Song Ling－Qin.Scutellariabarbateextract induces apoptosis of hepatoma H22cells via the mitochondrial pathway involving caspase－3［J］.World Gastroenterol，2008，14（48）：7321－7328.

［10］刘 文，赵佳荣，邓 桦，等.禽流感病毒与番鸭呼肠病毒感染番鸭免疫器官细胞凋亡的研究［J］.动物医学进展，2013，34（2）：37－43.

［11］王训翠，朱国旗，程 卉，等.新藤黄酸诱导人胃癌 MGC－803细胞线粒体途径凋亡的实验研究［J］.中药材，2014，37（1）：95－99.

［12］Yeh C H，Yang Y Y，Huang Y F，et al.Induction of apoptosis in human Hep3Bhepatoma cells by norcantharidin through ap53independent pathway via TRAIL／DR5signal transduction［J］.Chin J Integr Med，2012，18（9）：676－682.

［13］Dai X L，Zhou S L，Qiu Y F，et al.Correlated expression of Fas，NF－kappaB，and VEGF－C in infiltrating ductal carcinoma of the breast［J］.Urol J Gynaecol Oncol，2012，33（6）：633－639.

［14］Dai Zhi－Jun，Tang Wei，Wu Wen－Ying，et al.Antiproliferative and apoptotic effects ofβ－elemene on human hepatoma HepG2cells［J］.Cancer Cell Int，2013，13：27.

［15］曲 欣，李 鑫，蔡朋朋，等.连翘抗肿瘤活性成分体外诱导HeLa细胞凋亡作用［J］.中国公共卫生，2013，29（3）：397－399.

［16］Choi A Y，Choi J H，Yoon H，et al.Luteolin induces a apoptosis through endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction in Nuro－2amouse neuroblastoma cells［J］.Eur J Pharmacol，2011，668（1－2）：115－126.

［17］Du W Z，Feng Y，Wang X F，et al.Curcumin suppresses malignant glioma cells growth and induces apoptosis by inhibition of SHH／GLI1signaling pathwayinvitroandinvivo［J］.CNS Neurosci Ther，2013，19（12）：926－936.

［18］Zhang Jian，Wang Ju，Jiang Jiu－Yang，et al.Tanshinone IIA induces cytochrome c－mediated caspase cascade apoptosis in A549human lung cancer cells via the JNK pathway［J］.Int J Oncol，2014，45（2）：1791－2423.

［19］Zhao Y S，Zhu T Z，Chen Y W，et al.β－elemene inhibits Hsp90／Raf－1molecular complex inducing apoptosis of glioblastoma cells［J］.J Neurooncol，2012，107（2）：307－314.

［20］李 岩，赵剑璞，王燕妮，等.胡桃醌含药血清体外抗肿瘤实验研究［J］.北京理工大学学报，2013，33（5）：545－549.

［21］Jiang Z，Chai J，Chuang H H，et al.Artesunate induces G0／G1cell cycle arrest and iron－mediated mitochondrial apoptosis in A431human epidermoid carcinoma cells［J］.Anticancer Drugs，2012，23（6）：606－613.

［22］李玉英，赵淑娟，白崇智，等.苦荞麦槲皮素对人胃癌细胞SGC－7901增殖及细胞周期的影响［J］.中国细胞生物学学报，2013，35（5）：615－621.

［23］焦 宁，陈 冲，徐瑞荣.益气养阴方及其拆方对急性髓细胞白血病小鼠细胞凋亡及相关蛋白的影响［J］.中国中医药信息杂志，2014，21（2）：42－45.

［24］李 然，刘立萍，马 骥，等.小柴胡汤含药血清对肝癌HepG－2细胞的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：218－220.

［25］周昕欣，王彩霞.加味四君子汤含药血清对B16恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：178－181.

［26］王燚霈，朱 莹，邹君君，等.三物白散含药血清对胃癌 MGC－803细胞增殖、凋亡及survivin基因表达的影响［J］.中国中医急症，2013，22（3）：366－369.