朊病毒研究的前世今生

羊瘙痒病是羊群中的高度传染性疾病，由神经毒性朊蛋白聚集而致 ①

范式转移是科学进步的推动力，这一推动力未必在最初就获得交口称赞，而往往要历经轻蔑目光。这正是斯坦利·布鲁希纳（Stanley Prusiner）发表于1982年的论文的写照。他在文章中提出：羊瘙痒病是一种感染羊中枢神经系统的退行性疾病，其病因是一种“蛋白质类的传染性物质”，称为朊病毒（prion）。同行们回报以私下的窃笑。但布鲁希纳因其敏锐的洞察力获得了1997年的诺贝尔奖，并启发我们如何审视各种看似无关的疾病和生理过程，其深远影响至今可循。

在布鲁希纳发表这篇文章前的20年中，分子生物学领域取得了长足进展：科学家攻克了基因密码；阐明了DNA复制、转录和翻译的机制；实现了基因克隆的技术。这些发现为弗朗西斯·克里克（Francis Crick）构建“中心法则”奠定了基础，该法则认为信息流只能单向地从DNA流向蛋白质。不像宗教法则可能永恒不变，科学法则是无法避免其有效期的。布鲁希纳假设了朊病毒能够在没有核酸参与的情况下实现其复制周期。这一假说让人想到约翰·格里菲斯（John Griffith）在1967年提出的观点——具有自我复制能力的蛋白质可能存在，并能够解释羊瘙痒病的传播介质对破坏DNA的射线具有抵抗力的古怪现象。

丹尼尔·盖杜谢克（Daniel Carleton Gajdusek）证明库鲁病是通过巴布亚新几内亚人同类相食的行为传播的，并因此获得诺贝尔奖。他在1959年提出神经退行性疾病如库鲁病、羊瘙痒病和克雅氏病（CJD）都是由“慢发病毒”导致的。而朊病毒确实在很多方面与嗜神经病毒惊人的一致，像是定植于神经系统外的器官后通过外周神经侵入脑。但布鲁希纳提纯了这一介质后发现它比病毒要小得多，以至于不可能存在携带足够信息的核酸与之对应。通过不断研究，人们发现朊病毒疾病有很多种类，包括人类疾病（如致死性家族失眠症）和动物疾病（牛海绵状脑病，亦称作疯牛病或慢性消耗性疾病），但并没鉴定出致病性的病毒，而朊病毒作为发病机制的理论已被广泛接受。

朊病毒实际上与克里克的中心法则并非完全矛盾。查尔斯·魏斯曼（Charles Weissmann）不相信蛋白质能够脱离对应基因而存在，他通过研究在仓鼠中发现了细胞朊蛋白（PrPC）的基因，PrPC的错误折叠将导致紧密聚集物PrPSc的产生。普遍认为在聚合的PrPSc分裂为更小的形式时，朊病毒便会复制。这一更小的形式会进一步滋生出更多PrPSC，这一过程类似晶体的生长，并最终再次分裂，如此将复制周期进行下去。传染性朊病毒的“火种”如果进一步播散到周围的细胞，就会在中枢神经系统造成巨大破坏，导致神经元空泡（海绵样变性） 形成。

这是否意味着PrPSc就是朊病毒呢？魏斯曼在1993年发现敲除朊蛋白（Prnp）基因的小鼠不会得瘙痒病，这没能驳倒仅有蛋白质参与的假说。当然，Prnp基因敲除的小鼠也不足以证明朊病毒存在的假说。如果PrPC是“瘙痒病病毒”假想中的受体，那么敲除它就意味着小鼠会对瘙痒病不易感。2001年克劳迪奥·索图（Claudio Soto）发表了里程碑式的结果，为布鲁希纳的设想提供了更直接的证据：PrPSc聚集物在经历反复的碎片化并不断加入PrPC后，会发生聚集和再生，就能够任意地产生朊病毒。这些发现为结构信息可以水平地在蛋白质间传递的假说提供了更多证据。

这段时间，朊病毒的概念有时被过度宽泛地应用，用以描述任何中枢神经系统中蛋白质不断沉积的疾病，而没有考虑传染性是否存在——甚至应用在记忆形成的生理过程中。α-突触核蛋白聚集物能够在帕金森病患者的脑、培养的细胞以及小鼠中自我增殖，这是否就意味着α-突触核蛋白是一种真正的朊病毒，并需要高等级的生物安全标准来进行实验呢？类似的观点还有关于β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集物——阿尔茨海默病的特征性生物学标志物。但是朊病毒能够引起流行病，而没有证据证明其他蛋白质聚集物也能够引起流行——尤其是通过口口传播的途径。对于未被证实能够连续在多代宿主间传播的蛋白质聚集物，更好的描述是“类朊病毒”，即使它们在体外实验中同真正的朊病毒在增殖上有相同的分子机制。

正如布鲁希纳在他文章结尾做出的论断所述，“朊病毒革命”将会为阿尔茨海默病、帕金森病和许多以蛋白质聚集为特征的神经退行性疾病提供一种合理的理论框架，拓展了神经退行性疾病的研究领域。尽管现在已经发现细胞中PrPC对维持外周髓鞘的生理功能至关重要，我们对朊病毒的理解还是停滞了十多年，而落后于类朊病毒的研究水平。那么在布鲁希纳发现朊病毒后的40年中，我们究竟知道了哪些真相呢？

朊病毒研究的一个主要障碍是缺乏对PrPSc结构高清晰度解析的手段，其非溶解性、非晶体性聚集状态都为此增加了难度，同时通过重组蛋白从头合成高纯度的具有感染性的朊病毒更是难上加难。这提示真正具有感染性的聚集物可能是少见的一种结构异构体。如果这样，多数体外合成得到的就不会具有感染性，对解析朊病毒及其复制机制而言毫无价值。

纵观现今朊病毒的理论模型，最可靠的假说认为朊病毒由一种纤维组成，这种纤维形似四阶的b-螺线管，通过头对头或头对尾的方式聚集在一起。通过冷冻电镜分析纯化的非糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的朊病毒纤维的结果支持这一假说，这也是人类首次获得感染性朊病毒的高倍率图像，尽管图像的分辨率不足以判断纤维中单体的精确排列方式。这一结构与tau蛋白、α-突触核蛋白和Aβ都有显著的差别，也和重组的PrP纤维有差异，很大的不同在于这一结构不是由长纤维组成的，而是形成空腔结构的。因此，PrPSc具有其独特的结构特征，但不明确其骇人的传染性是否与之有关。

PrP聚集物同其神经毒性间的关联尚不明确。大量的证据暗示PrPC是毒性的必要因素，或许由于细胞外PrPSc寡聚体能够锚定多种细胞表面的PrPC。另一个朊病毒感染的特异之处在于其对脑伤害的特异形态学特征。在所有具有聚集倾向的蛋白质中，朊病毒是唯一能够造成广泛神经元内空泡（海绵样变性）形成的，严重程度随着疾病进展而加重。这一神秘的现象引起了科学家的注意。至今，我们对空泡形成的细胞和分子病理学机制几乎一无所知，但由于这一现象出现在所有已知的朊病毒疾病中，可以推断其可能是朊病毒毒性的一个关键因素——因此也就会是治疗干预的一个靶向目标。

朊病毒的高分辨率三维结构解析对解决长期以来关于朊病毒毒株的问题也至关重要，这些朊病毒可能具有相同的PrP序列却导致不同的疾病（如传染性水貂脑病中“亢奋”和“嗜睡”的不同表型），且这些特征能够在连续的传染中维持不变。病毒毒株被定义为基因组的多态性，朊病毒毒株的存在长期以来被认为是其具有核酸的无可争辩的证据。然而在超过40年的努力后，我们没有分离得到任何瘙痒病特定的基因组，毒株也就被解释为不同的PrPSc构象所导致的结果，而这些构象能够通过构象敏感的荧光聚噻吩所鉴别。

朊病毒研究领域的窘境在于，至今还没有决定性的结构证据能够支持以上的假说，而真正具有传染性的朊病毒“毒株”仍是由不完美的替代性生物学标志物——比如对解聚和蛋白酶解的抵抗力——所鉴别。与之相反，一些类朊病毒疾病在不同临床表型中对应的结构异质性已被发现，尽管不同的构型在连续传染实验中的稳定性模型仍没有完全建立。

那么朊病毒毒株在代代传染中的稳定性又如何呢？RNA病毒通过形成准种来获得最佳的适应性，许多变种处在适应性突变和错误后灭绝间的不稳平衡中。值得注意的是，朊病毒也能够在人为给予不同的选择压力下产生准种，其单株成分能够从培养的细胞中分离出来。这一现象的结构机制不明，也可能涉及不同PrPSc种类的构象选择。构象选择模型意味着单个受感染的机体中共存多种构象异构体，其中一些在特定环境中会有更高的增殖效率。不同毒株朊病毒的培养时间有巨大的差异，朊病毒发病前的潜伏期长度可能就反映了这一选择发生所需的时间。

PrPSc异构体的特异性中或许潜藏着控制朊病毒种间传播的障碍，朊病毒的传播强度多变，与宿主及朊病毒毒株密切相关。朊病毒从牛到人的传播导致了各类CJD，但羊朊病毒多数对人无害。这一种间屏障的形成归功于接种物中PrPSc的结构差异性，以及宿主的PrPC差异，PrPC并不总会与错误折叠的异构体高效率地交互。

这一由布鲁希纳发展的概念经历了巨大的变化。现如今，蛋白质聚集物的模块样聚集被认为不仅仅是疾病的基础，也与许多生理过程息息相关，尽管可能与当初引起布鲁希纳兴趣的现象毫无相似之处。我们已经建立了一些类朊病毒疾病的结构预测模型，但却拿朊病毒毫无办法。一些1982年由布鲁希纳提出的问题——朊病毒结构、复制机制以及毒力因素——仍是未解之谜。基于史实，我们可以认为：朊病毒研究领域的研究成果将会为更广泛的神经退行性疾病提供全新的思路。

资料来源 Science