煤矸石淋滤液对小麦种子及幼苗的生态毒性研究

李云玲 侯沁文 任嘉红

(1.长治学院生物科学与技术系，山西 长治 046011；2.太行山生态与环境研究所，山西 长治 046011)



煤矸石淋滤液对小麦种子及幼苗的生态毒性研究

李云玲1,2侯沁文1,2任嘉红1,2

(1.长治学院生物科学与技术系，山西 长治 046011；2.太行山生态与环境研究所，山西 长治 046011)

以山西省农业科学院提供的小麦品种长麦6135为研究对象，采用室内培养方法和柱状淋溶装置，模拟大气降水，用5个不同浓度的煤矸石淋滤液处理小麦种子，分析其对小麦发芽势、发芽率、叶绿素含量和抗氧化酶活力等的影响。结果表明：煤矸石淋滤液对小麦种子的发芽有一定抑制作用，浓度越高，抑制作用越显著，煤矸石淋滤液浓度为720.8 mg/L时小麦发芽势和发芽率均最低，分别为65.6%、69.0%。煤矸石淋滤液浓度为324.5～720.8 mg/L时，小麦芽长与苗高均显著低于对照组,当浓度为451.5～720.8 mg/L时，小麦苗质量显著低于对照组；叶绿素含量与煤矸石淋滤液浓度呈线性负相关。不同煤矸石淋滤液浓度的小麦幼苗POD活性差异性显著，而SOD和CAT活性差异性极显著；不同部位的POD和SOD活性差异极显著；不同时间POD和CAT活性差异极显著。因此，煤矸石淋滤液对小麦种子发芽和幼苗生长具有一定的生态毒性。

煤矸石淋滤液；小麦；种子；幼苗；生态毒性

煤矸石是采煤、洗煤及煤炭加工过程中排放量最大的固体废弃物。我国每年煤矸石排放量约占当年煤炭产量的10%～15%，堆放的煤矸石经淋溶形成的废水是矿区主要污染源之一，具有酸度大、重金属浓度高等特点，污染土壤和地下水[1-5]。随淋溶时间的延长，土壤中重金属含量增加，且一些金属元素如Cd、Pb、Mn、Zn等有较强的迁移性[6-8]，从而进一步扩大周边土壤和水源的污染，造成农作物减产甚至绝收，危及居民用水安全。

目前，国内外对煤矸石的研究主要集中在重金属、淋溶特性、应用等方面。Bhuiyan等[9]对孟加拉国北部矿区周边的农田土壤进行了重金属测定，发现铁、锌、铅、钛、锰等的平均浓度高于世界平均正常水平。侯新伟等[3]研究证明了长期堆放煤矸石会使其中污染物进入周围土壤从而造成对土壤的污染。张燕青等[6]对煤矸石中金属离子的淋溶特性和污染情况进行了研究，发现降雨量和降雨次数的增加会促进煤矸石中污染物的溶解和释放。在环境污染物的生态毒性方面，关于有毒污水、污泥、固体废料等对农作物生态毒性的研究已开展了不少工作[10-16]，但有关煤矿污染对农作物影响的研究较少[17]。有学者开展煤矸石中重金属对土壤和农作物(水稻Oryzasativa、大豆Glycinemax)的污染情况研究，发现重金属可通过食物链转移，进而威胁人类的健康[18]。采用矿井废水灌溉，对小麦(Triticumaestivum)生长及土壤环境会产生较大程度的影响[19-20]。然而有关煤矸石淋滤液对农作物的生态毒性研究甚少，因此，本研究采用不同浓度煤矸石淋滤液来处理小麦，通过分析小麦种子的发芽势、发芽率、芽长、根长、苗长、鲜质量、叶绿素含量以及抗氧化酶活性的变化，探讨煤矸石淋滤液对我国重要农作物小麦潜在的生态毒性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

煤矸石样品采自山西省潞安矿区；试验小麦品种为长麦6135，由山西省农业科学院谷子研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 煤矸石淋滤液的制备 参照肖利萍等[21]采用的柱状淋溶装置，使用直径为10 cm、高为120 cm的筒式分液漏斗，在其底部铺设两层定量滤纸，将煤矸石用破碎机粉碎成粒径≤10 mm的颗粒，然后装入1.5 kg的煤矸石样品，将其振实后，用去离子水润湿20 ～ 24 h，模拟大气降水，间歇式加水进行淋溶，下面用1 000 mL样品瓶收集淋滤液，按照长治市年平均降雨量计算，每次收集950 mL淋滤液，收集5个不同浓度煤矸石淋滤液，分别为128.6、217.1、324.5、451.5、720.8 mg/L。

1.2.2 种子发芽和幼苗生理生态毒性测定 挑选颗粒饱满、粒径大小一致、无病害的小麦种子，先用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 min进行消毒，然后用蒸馏水反复清洗5～6次，最后将小麦种子放置在铺设两层滤纸的培养皿中，培养试验煤矸石淋滤液浓度为0、128.6、217.1、324.5、451.5、720.8 mg/L，每个浓度为1个处理，每个处理设置3次重复，每个培养皿里30粒小麦种子，置于25 ℃培养箱中培养。每天记录种子发芽数，以幼根长0.1 ～ 0.2 mm作为发芽标准，从培养第2 d起开始记录；第3 d计算发芽势(%)，发芽势测定参照王彦梅等[22]的方法进行；第7 d计算发芽率(%)；7 d后随机测定部分小麦幼苗的芽长、根长、苗高、鲜质量，并测定其叶绿素含量。于7 d和15 d时测定小麦叶片和根的POD、SOD和CAT活性。

叶绿素含量的测定按照Hegedüs等[23]的方法进行，称量0.5 g小麦幼苗，丙酮∶乙醇=1∶1的混合溶液提取，在645 nm和663 nm波长下测定吸光值，计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。抗氧化酶活力主要测定POD、SOD和CAT活性，其中POD活性测定，采用愈创木酚法[24]，每秒内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小。SOD活性测定，采用氮蓝四唑法[24]，以抑制反应的50 %来表示1个酶活力单位(U)。CAT活性测定，采用分光光度法[25]，以1 s内A240减少0.01的酶量为1个酶活单位(U)，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小。

1.2.3 数据统计与分析 采用Excel 2003进行数据初步处理，利用DPS 7.05和Origin 8.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 煤矸石淋滤液对小麦种子发芽的生态毒性

随着淋滤液浓度的增加，小麦种子的发芽势、发芽率逐渐降低(图1)。淋滤液浓度为128.6～324.5 mg/L，小麦发芽势与对照组差异不显著，高浓度淋滤液(451.5、720.8 mg/L)的发芽势显著高于对照组(P<0.05)；淋滤液各浓度处理的小麦发芽率均显著高于对照组(P<0.05)。淋滤液浓度为128.6～720.8 mg/L的小麦芽长显著高于对照组，浓度为324.5～720.8 mg/L的根长显著高于对照组。

2.2 煤矸石淋滤液对小麦苗高和苗重的生态毒性

不同浓度煤矸石淋滤液对小麦苗的高和质量表现出不同程度的抑制作用,随着煤矸石淋滤液浓度依次增大，小麦苗高和质量呈递减规律，煤矸石淋滤液浓度越大则生长受阻越明显,见图2。由方差分析结果表明，浓度为720.8 mg/L的滤液处理组小麦苗高和质量均极显著低于对照组；浓度为451.5 mg/L的滤液处理组小麦苗高极显著低于对照组，而质量则是显著低于对照组；浓度为324.5 mg/L的滤液处理组小麦苗高显著低于对照组，而质量与对照组差异不显著；浓度为128.6、217.1 mg/L处理组各项指标与对照组比较差异均不显著。可见，低浓度(128.6、217.1 mg/L)煤矸石淋滤液对小麦的苗高和质量影响不明显，随着煤矸石淋滤液的累积作用增加，其对小麦苗高的抑制作用越来越明显。

2.3 煤矸石淋滤液对小麦幼苗叶绿素的影响

以叶绿素含量对煤矸石淋滤液浓度进行线性回归，结果见图3。由图3可知，在叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量中均为线性负相关，且呈现极显著相关性(P<0.01)。相关系数大小顺序为叶绿素a(R=0.980)、叶绿素b(R=0.876)、总叶绿素(R=0.974)。所有浓度处理的叶绿素含量都低于对照组，而且随着煤矸石淋滤液浓度的增加，叶绿素含量逐渐减少。

2.4 煤矸石淋滤液对小麦叶片及根内抗氧化酶系的生态毒性

煤矸石淋滤液对小麦叶片及根内抗氧化酶系的影响见表1。由表1可知，不同浓度煤矸石淋滤液对小麦叶片及根内3种抗氧化酶的影响随滤液浓度、小麦不同部位和时间呈现不同变化趋势。

1) 叶片中抗氧化酶POD活性：7 d时，POD值除滤液浓度为128.6 mg/L处理高于对照组外，其他处理均低于对照组，且随淋滤液浓度增加而降低；15 d时，POD值变化趋势与7 d时相反，其中，对照组最低，滤液浓度为720.8 mg/L的最高。

2) 叶片中SOD活性：7 d时，对照处理的SOD活性最高，SOD酶活性随着淋滤液浓度增加逐渐降低；15 d时，SOD酶活性随着淋滤液浓度增加变化趋势为“高—低—高”。

3) 叶片中7 d与15 d的CAT活性变化趋势基本相同：淋滤液浓度为128.6～324.5 mg/L时，随着滤液浓度增加CAT活性略有降低；而淋滤液浓度达324.5～720.8 mg/L时，CAT活性则明显降低。

表1 煤矸石淋滤液对小麦叶片及根内抗氧化酶系的生态毒性Tab.1 Ecotoxicity of Coal gangue leaching filtrate on the antioxidant enzymes in the leaf and root of wheat seedlings

从根部中抗氧化酶来看，随煤矸石淋滤液浓度及胁迫时间的变化趋势与叶片内基本相似,所不同之处是POD、SOD和CAT这3种酶在小麦不同部位活性表现不一致。叶片的POD活性要显著低于根部，SOD活性与根部相当， CAT则显著高于根部，说明在植物体不同部位同一酶类的分布是有差异的，也进一步说明同一酶类对于植物体不同部位的重要性也是不同的。以煤矸石淋滤液、小麦部位和生长时间为因素进行方差分析，结果见表2。

在不同煤矸石淋滤液浓度水平间，POD活性差异显著，而SOD和CAT活差异性极显著；在不同部位下，CAT活性差异不显著，POD、SOD活性差异极显著；在不同时间下，POD和CAT活性差异极显著，SOD活性差异不显著。煤矸石淋滤液浓度与部位、时间与部位二因素交互作用下POD和SOD活性差异都极显著，CAT活性差异性不显著，在淋滤液浓度与时间二因素交互作用下3种酶活性差异均显著；淋滤液浓度、部位与时间三因素交互作用下仅有POD活性差异极显著。

表2 小麦叶片及根内抗氧化酶活性的方差分析Tab.2 Analysis of variance of enzymatic activities in the leaf and root of wheat seedlings

注：A为滤液浓度，B为部位，C为时间。*为差异显著(P<0.05)，**为差异极显著(P<0.01)。

3 结论与讨论

1) 高等植物的毒理试验方法包括发芽、根长及早期幼苗的生长试验，通过这些试验观察在污染条件下植物的发芽情况、根系发育状况等指标的变化程度，进而可以十分方便、快捷对污染进行诊断，是一种评价生态环境毒性的优选方法[26-27]。小麦种子是普遍推荐的供试材料之一[28]，但目前少见采用小麦材料检测煤矸石毒性的相关报道。基于此，本试验采用煤矸石淋滤液培养小麦，通过记录小麦种子的发芽势、发芽率，测量其芽长、根长、苗高和鲜质量。结果表明，煤矸石淋滤液从低浓度(128.6 mg/L)到高浓度(720.8mg/L)对小麦发芽率抑制作用均较显著，且浓度越高，抑制作用越显著；而小麦发芽势在较低浓度(< 324.5 mg/L)时抑制作用不显著；同样，较高浓度(451.5～720.8 mg/L)的煤矸石淋滤液对小麦的芽长、根长、苗高和苗质量也表现出一致的抑制作用。

2) 叶绿素是植物进行光合作用的色素，叶绿素含量高低在一定程度上反映了光合作用的水平，其含量和组成是影响光合作用的物质基础[29-30]。本试验结果表明，煤矸石淋滤液对叶绿素含量的影响也是随着其浓度的增高而增强，对幼苗叶绿素a和b的影响基本一致。Stobart等[31]研究结果表明，重金属污染对叶绿素含量有影响，与本研究结果相一致，其可能原因为：(1)煤矸石的重金属及其他污染物抑制叶片中叶绿素酸酯酶的合成；(2)重金属影响了氨基-γ-酮戊酸的合成，而这两种物质均是植物合成叶绿素所必须的酶和物质，在重金属污染的影响下由于两者合成受阻，从而造成叶绿素含量的下降；(3)由于破坏了细胞膜的结构而引起。因此，在煤矸石淋滤液胁迫条件下，植物对光能的利用效率降低。

3) 活性氧包括羟自由基、超氧自由基、过氧化氢和过氧化物自由基等,当它在细胞内大量积累时，会引起细胞膜脂的过氧化。正常情况下，生物体内抗氧化系统会清除这些活性氧，其中POD主要清除过氧化物自由基，CAT主要清除过氧化氢自由基，SOD主要清除超氧自由基。Polesskaya等[32]研究表明，由于内源和外源异生物质的作用，植物体内发生一系列生化反应，产生大量活性氧，可导致机体内的核酸、膜脂、蛋白质等氧化，甚至造成酶失活、膜脂过氧化和DNA断裂等一系列氧化应激。Ma等[20]以小麦为指示作物，研究发现矿井废水的灌溉显著降低了土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性，并导致小麦籽粒产量下降。本研究对不同浓度煤矸石淋滤液处理小麦的叶、根中的POD、SOD、CAT酶活性进行测定，并针对不同部位和不同时间的酶活性进行分析，发现处理小麦不同部位在不同时间下各酶活性表现并不完全一致，但综合来看，随着时间增加，较高浓度处理酶活性升高，而低浓度处理酶活性则下降，这可能是小麦抵抗煤矸石淋滤液胁迫的一种应激反应机制。

因此，煤矸石淋滤液不仅影响小麦发芽率、芽长、苗高和鲜质量，而且引起小麦生物功能失调，进而表现出一系列的叶绿素合成受阻和氧化损伤等效应，必将会导致农作物产量的降低。因此，我国有必要加强对煤矸石的处理，减少煤矸石的无节制堆放，尽量降低其对周围环境和农作物的影响。

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(责任编辑 韩明跃)

Ecotoxicity of Coal Gangue Leaching Filtrate on Wheat Seed and Seedlings

LI Yun-ling1,2，HOU Qin-wen1,2，REN Jia-hong1,2

(1.College of Biological Sciences and Technology,Changzhi University,Changzhi Shanxi 046011, China；2.Ecological and Environmental Research Institute of Taihang Mountain,Changzhi Shanxi 046011,China)

Using wheat variety Changmai 6135 provided by Shanxi academy of agricultural sciences as material,simulating rainfall by columnar leaching equipment,the effects of coal gangue pile on plant growth,the ecotoxicity of coal gangue leaching to seed germination and seedling growth of wheat were assessed by indoor culture methods.The results showed that coal gangue leaching filtrate could inhibit wheat seed germination in some extent,and there was a positive correlation between the inhibitory effect and the concentration.When the concentration of coal gangue leaching filtrate was highest(720.8 mg/L),the germination potential(65.6%)and germination rate(69.0%)of treatment group were the lowest.Wheat seedling weight in the group treated with leaching filtrate(451.5～720.8 mg/L)was significantly lower than in the control group;The length of shoot and seedling height were also repressed significantly by leaching filtrate(324.5～720.8mg/L);There was a significant linear negative correlation between chlorophyll content and the concentration of coal gangue leaching filtrate(R>0.85).There was a significant difference in wheat seedling POD activities of the groups treated with coal gangue leaching filtrate at different concentrations,and an extremely significant difference in SOD and CAT respectively.Besides, the difference of POD and SOD of different parts was extremely significant,as well as POD and CAT of different time.In short,coal gangue leaching filtrate had a certain ecological toxicity effect on wheat seed germination and seedling growth.

coal gangue leaching filtrate;wheat;seed;seedling;ecotoxicity

2015-03-09

山西省高校重点学科建设专项资金项目(20111050，20111051，20131008)资助。

任嘉红(1976—)，女，博士，教授。研究方向：森林微生物。Email：renjiahong@163.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.04.007

S723.1

A

2095-1914(2015)04-0039-07

第1作者：李云玲(1976—)，女，硕士，讲师。研究方向：森林微生物。Email:lyl_0315@163.com。