番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道

汤亚飞，何自福＊，杜振国，佘小漫，蓝国兵，罗方芳

（1.广东省农业科学院植物保护研究所，广州 510640；2.广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640）

番茄黄化曲叶病是世界范围内严重影响番茄生产的一种重要病害，已给热带和亚热带地区的番茄生产造成严重损失［1］。田间番茄染病后表现为植株矮化，叶片黄化、变小，叶片边缘向上卷曲。生长发育早期染病时，植株无法正常开花结果；后期染病，植株上部新叶表现症状，结果量减少，果实变小，失去市场价值。

番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurl virus，TYLCV）是引起全球各地番茄黄化曲叶病的主要病原之一。该病毒属双生病毒科（Geminiviri-dae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）成员，其基因组仅含A 组分（DNA-A），为单链环状；该病毒由烟粉虱以持久方式传播，同时可经嫁接传播，不能经机械摩擦或种子传毒；其寄主有番茄、曼陀罗、辣椒、菜豆、烟草等［2］。TYLCV 最先在以色列发现，之后随着烟粉虱在全球范围暴发而蔓延至中东、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亚洲等多个国家和地区［3］。2006年，该病毒传入我国上海［4］，之后在浙江、江苏、安徽、山东、河北、天津及北京等多个省市发生，造成严重损失［5-15］。2014年春季，湖北省武汉市田间番茄病株表现出严重的黄化、曲叶症状，疑似感染了双生病毒。为了明确引起湖北省武汉市番茄黄化曲叶病的病原种类，笔者对6份病样进行了病原分子鉴定，对代表分离物的全基因组进行了克隆及序列分析。

1 材料与方法

1.1 供试样品

6份疑似番茄黄化曲叶病的病叶片（编号分别为HB01～06）采自湖北省武汉市一个试验大棚，病株表现为植株矮缩，叶片皱缩、叶缘黄化；3 份阳性样品为本实验室通过农杆菌介导TYLCV 侵染性克隆注射接种发病的番茄叶片；2 份阴性样品为本实验室保存的健康番茄叶片。

1.2 供试番茄样品总DNA 提取

利用CTAB方法［16］提取各供试番茄叶片组织的总DNA。

1.3 PCR 检测

利用菜豆金色花叶病毒属病毒通用简并引物AV 494／CoPR［17-18］，对11份供试样品进行PCR检测。

1.4 RCA扩增及酶切分析

随机挑取PCR 检测为阳性的病样HB01 和HB02总DNA，分别取1.0μL 为模板，利用TempliPhiTMRCA Kit（GE Healthcare）进行滚环扩增（rolling circle amplification，RCA），以获得病毒的全基因组。具体方法按照试剂盒说明书上的步骤进行。

RCA 反应结束后，扩增产物分别用BamH I、Hind Ⅲ、PstI限制性内切酶进行酶切。酶切反应体系为：RCA 产物2μL、内切酶1μL、10×内切酶缓冲液1μL，总酶切反应体系为10μL。在37 ℃条件下酶切2h以上，然后进行电泳分析。若某个内切酶的酶切产物为2.5～3.0kb，或同时还产生1.3 kb左右的条带，则克隆这些特异性条带。

1.5 序列分析

利用DNAStar 软件（DNASTAR Inc，Madison，USA）进行序列拼接，利用BLAST 程序进行序列相似性搜索，进一步用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，进化树构建采用MEGA 5.05 的邻接法（neighbor joining，NJ）。

2 结果与分析

2.1 PCR 检测结果

利用菜豆金色花叶病毒属病毒特异简并引物AV494和CoPR 进行PCR 检测，从6份表现黄化、曲叶症状的番茄病样（编号分别为HB01～06）总DNA 中均扩增到1条与阳性对照大小一致的特异片段，长度为570bp，而健康植株样品总DNA 中未扩增出任何片段（见图1）。表明6份样品中均含有菜豆金色花叶病毒属病毒。

图1 番茄样品PCR 检测结果Fig.1 PCR detection result of tomato samples

2.2 病毒分离物基因组的克隆与序列分析

选取病样HB01 和HB02 的总DNA 分别进行RCA 和酶切反应，结果显示，其RCA 产物均能被BamH I切出1条约2.7kb大小的单一条带。克隆和序列测定结果表明，这2 个片段序列全长均为2 781nt，且两者的序列同源率为99.8%，即为病毒分离物DNA-A的全基因组。以HB01的全长序列代表该病毒分离物基因组，其GenBank登录号为KJ850344。

病毒分离物HB01的基因组全长序列具有单组分菜豆金色花叶病毒属成员基因组DNA-A 的典型特征，为单链闭合环状，推导编码6个ORFs。基因组病毒链含AV1基因（308～1 084nt，编码CP）和AV2基因（148～498nt，编码与病毒移动相关蛋白），互补链含有AC1基因（1 542～2 615nt，编码复制酶）、AC2基因（1 226～1 633nt，转录激活蛋白）和AC3基因（1 081～1 485nt，编码复制增强蛋白）和AC4基因（2 171～2 464nt）。在AV2与AC1之间有一个313nt的非编码区（位于2 616～147nt），其中含有与双生病毒复制起始有关的保守序列TAATATTAC［19］（位于2 775～2nt）。

BLAST结果显示，与HB01DNA-A 序列有较高同源性的序列均为TYLCV 分离物DNA-A。进一步比较结果显示，HB01DNA-A与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源性均在97%以上，其中与来自上海（TYLCV-SH2，AM282874）、浙江（TYLCV-ZJ3，AM698117）和安徽（TYLCV-AH-HB1，FN650807）3个分离物DNA-A的同源性最高，均为99.4%。

为了分析病毒分离物HB01与已报道的各TYL-CV 分离物的亲缘关系，本文选取了来自我国不同地区的12 个分离物以及国外不同国家来源的19 个TYLCV 代表分离物，以我国台湾番茄曲叶病毒白沙分离物（TomatoleafcurlTaiwanvirus，ToLCTWV，DQ237918）为外组构建系统进化树。从该系统进化树（图1）可以看出，HB01与来自中国不同地区的12个分离物及国外的11个分离物亲缘关系较近，聚在一个分支，进一步与来自科威特的KISR分离物形成一个大的分支；而与日本Mild［Tokai］分离物、西班牙Mild［Spain7297］分离物、留尼汪岛分离物、日本Sz分离物、阿巴代分离物、伊朗分离物及阿曼Tom-48分离物等7个分离物的亲缘关系相对较远。

图2 HB01与其他31个TYLCV分离物的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of HB01and 31isolates of TYLCV

3 讨论

虽然番茄黄化曲叶病已在我国上海、浙江、江苏、安徽、山东、河北、河南、天津、北京、吉林、陕西、广东、广西、福建、海南、云南、新疆、宁夏、重庆、辽宁、甘肃、四川等20多个省（市、自治区）相继发生，但对于湖北来说还是一个新病害。本文应用RCA 方法从来自湖北的番茄病样中扩增获得病毒分离物HB01的全基因组序列，该序列与国际上已报道的TYLCV各分离物同源性均在89%以上，其中与来自我国其他地区的TYLCV 分离物的同源率均在97%以上。因此，根据目前国际双生病毒分类方案［2］，确定侵染湖北番茄的病毒分离物HB01属于TYLCV的一个分离物，这是首次在湖北省检测到该病毒。

自2006年Wu等［4］首次报道TYLCV入侵我国以来，该病毒已扩散到我国20多个省（市、自治区），并造成严重损失。本研究通过比较病毒分离物基因组序列发现，我国各地分离物的同源性在97%以上。这说明：虽然该病毒入侵我国将近10年，但其种群的遗传依然比较稳定。当然，由于该病毒在田间与其他双生病毒存在复合侵染［20］，TYLCV是否会与其他病毒进行重组产生新株系或新病毒，还需要进一步监测。

近年来，湖北番茄栽培面积呈扩大趋势，尤其是高山番茄，市场效益好，发展迅速，面积逐年扩大，现已成为湖北省高山蔬菜高效栽培的主要品种之一。本研究首次在湖北番茄上发现番茄黄化曲叶病疫情，说明该病毒也开始入侵到湖北省，应引起有关部门和生产者的重视。积极采取有效的防范措施，预防与控制该病在湖北省传播、扩散和流行。

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