福建省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定分析

张前荣，温庆放，李大忠，刘建汀，李永平,代春兰，薛珠政，康建坂，王　彬，朱海生 *

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建　福州　350013；2.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建　福州　350013； 3.福建省蔬菜工程技术研究中心，福建　福州　350013)



福建省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定分析

张前荣1,2,3，温庆放1,2,3，李大忠1,2,3，刘建汀1,2,3，李永平1,2,3,代春兰1，薛珠政1,2,3，康建坂1,2,3，王彬1,2,3，朱海生1,2,3*

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建福州350013；2.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建福州350013； 3.福建省蔬菜工程技术研究中心，福建福州350013)

为了对福建省发生的番茄黄化曲叶病毒病的病原进行分子鉴定，并对其病原分子的变异和进化情况进行分析。根据已知的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)基因组序列设计特异引物进行PCR扩增，对获得的特异性片段回收、克隆并测序，结果表明，PCR分子标记反应扩增到541 bp的特异性条带，将该特异性产物经回收和纯化并进行克隆与测序，测序结果经BLAST比对后，表明该分离物的序列与国内外的病毒序列相似度为97%～99%。试验结果表明福建省的5个地市的番茄均已被番茄黄化曲叶病毒病危害，应当加强防治。

番茄；番茄黄化曲叶病毒；鉴定

番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD)，系由双生病毒科菜豆金色花叶病毒属的番茄黄化曲叶病毒引起的，依靠烟粉虱持续传播，因此该病毒又称为粉虱传双生病毒[1-3]。该病毒的核酸主要由DNA-A和DNA-B组成，其大小约为2.5～3.0 kb，少数病毒为单组份[4]，不仅侵害番茄，还能够寄宿在辣椒、马铃薯、棉花、木薯等农作物[5]。

20世纪30年代末，番茄黄化曲叶病毒病首次在约旦-以色列一带被发现。1964年，才被正式命名为番茄黄化曲叶病毒病(TYLCD)[6]。该病毒病是一种毁灭性的病害，已在约旦、以色列、日本、美国、澳大利亚等国家地区均有大面积的发生，已造成严重损失[7-10]。1995年该病传入我国[11]，该病已在我国的浙江、上海、山东、河南、重庆、广西、广东、云南等多个省市自治区发生[12-16]。

福建省龙岩市、莆田市、福州市等地市均有大面积的番茄栽培，因此开展番茄黄化曲叶病毒发生情况调查分析研究，并提出防治方法具有重要的意义。分子标记技术能够快速准确鉴定出该病毒，在植物样品检疫鉴定起到重要的作用。本研究利用分子标记技术鉴定分析福建省的采集的番茄病株样品，并对特异性分离物进行纯化、克隆、测序、比对、分析该分离物与世界各地分离物的同源性，确定病毒类型，并提出防治该病毒的方法。

1　材料和方法

1.1病毒样品采集

2015年在福建省的福州、莆田、厦门、漳州、龙岩地市等5个地区采集番茄黄化曲叶病毒病病样。

1.2病毒DNA提取及PCR检测

病毒DNA的提取方法采用经典CTAB法[17]。引物设计参考谢艳等[5]的简并引物：CTYPA:TAATATTACC(G或T)G(A或T)(G或T)G(A，C或G)CC(C或G)C；JCTYPB:TGGAC(C或T)TT(A或G)CA(A或T)GG(C,T或G)CCTTCACA。

25 μL反应体系：番茄叶片总DNA 2 μL(100 ng)；Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；PA 0.5 μL，PB 0.5 μL。

PCR反应条件：94℃变性5 min ；94℃变性30 s， 55℃复性45 s， 72℃延伸30 s，35 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3克隆和测序分析

利用回收试剂盒对PCR扩增产物中约540 bp的特异性条带进行回收、纯化、克隆到载体pMD18-T(TaKaRa公司)，取阳性菌落，经培养后进行测序。测序结果登录NCBI 网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的BLAST进行比对分析。

2　结果与分析

2.1番茄黄化曲叶病毒的田间调查症状

从福建省内各地采集的番茄植株病样，其田间表现为植株生长缓慢甚至停滞，节间变短，严重矮化，上部新叶新芽增厚且变小、叶质变硬和脆、叶片退绿变黄，叶片边缘至叶脉区域发黄、具有凹凸不平的皱褶或变形，后期褶皱簇状叶片缘向上卷曲；新叶有黄绿不均，叶片严重变形且焦枯，番茄果实畸形、变小，或不能正常开花结果，坐果困难，果实僵化不膨大，或膨大速度极慢着色不均匀，不能正常转色，成熟慢，结果数减少，商品价值减低，产量大幅下降。其田间表现性状与国内外报道的番茄黄化曲叶病毒病性状相似度很高。

2.2番茄黄化曲叶病毒的特异性片段分析

以感病叶片的病毒DNA为模板进行PCR扩增反应，其产物经琼脂糖凝胶电泳检测。以健康的番茄植株叶片为对照，病样通过扩增获得大小约为540 bp左右的特异性条带(图1)，而健康植株未出现特异性条带。对特异性条带进行回收、纯化、克隆到载体pMD18-T及测序。通过测序得到541 bp的片段序列，其序列见图2。同时对测序结果进行BLAST比对，确认其为番茄黄化曲叶病毒的AV1的相关基因。

2.3福建地区分离物与国内外分离物分析

从福建省内采集的病毒病样的分离物的部分序列与已在GenBank登录的国内山东、浙江、上海、北京、新疆、辽宁等省市的分离物序列相似性最高，均为99%，与美国夏威夷、墨西哥、以色列韩国济州岛、日本冲绳等国家地区的相似度为99%。与江苏、山西、河北、河南、约旦的病毒相似度为98%，而与墨西哥危害马铃薯的番茄黄化曲叶病的相似度为97%(表1)。

3　讨论与结论

TYLCVD是一种世界灭顶性灾害，是亚热带和热带番茄的重要病害之一，分布极为广泛，严重威胁了番茄产业的发展[18]。TYLCV的传播介体为烟粉虱，寄主广泛，近年来全球气候变暖，烟粉虱的适应力不断增强使其大量繁殖传播，加快了TYLCV的传播，使得TYLCVD对番茄的为害越来越严重[19]。分子标记是一种快速准确检测鉴定番茄黄化曲叶病毒病的方法，本研究对福建省的5个地市的番茄病毒进行PCR检测，均扩增检测到番茄黄化曲叶病毒，再次验证了分子标记技术能够运用于病毒诊断鉴定。

番茄黄化曲叶病毒病的 DNA-A 全长约为2.8 k个核苷酸，共编码 6 个开放阅读框架(ORF)，分别是AV1(CP)(308～1 084 nt)编码外壳蛋白，AV2(148～498 nt)以及位于互补链的AC1(Rep)(1 542～2 615 nt)编码病毒复制所必需的复制相关蛋白，AC2(Ren)(1 226～1 633 nt)编码复制增强蛋白，AC3 (TrAP)(1 081～1 485 nt)编码控制晚期基因表达的转录激活蛋白和 AC1 内还编码一个AC4 蛋白(2 171～2 464 nt)[20-22]。从福建省番茄黄化曲叶病毒分离的分离物的大小为541 bp，经比对确定该分离是编码病毒外壳蛋白的AV1基因的序列，为克隆分析福建省番茄黄化曲叶病毒DNA-A全长奠定了基础。

根据国际病毒分类委员会的规定，双生病毒科的基因组核苷酸序列相似度不小于89%为同一种病毒的不同株系或分离物[23]。番茄黄化曲叶病毒是一种单链环状DNA病毒，存在基因重组变异现象，虽然各地报道病毒名相同，其序列可能相差较大，而与同属病毒的相似度很低[20,24]。据全国各地研究人员报道我国的番茄黄化曲叶病毒分离物的核苷酸序列相似度较高，与世界其他国家地区的相似相对较低，而与同属菜豆金色花叶病毒属的其他病毒相似度低89%。据田守波[22]报道山东莘县的番茄黄化曲叶病毒分离物(TYLCV-IL)与上海、河北等地区的同源性为98.2%～98.8%，与欧洲地区的同源性达到91.0%，而与其他菜豆金色花叶病毒属病毒同源性为 66.1%～70.1%。刘玉乐等[25]在分离到广西番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-CHI)，与TYLCV-ISR(以色列分离物)、TYLCV-THA(泰国分离物)、TYLCV-SAR(撒丁分离物)、TYLCV-SI(意大利西西里分离物)的共同区 DNA 序列相比对，其同源性仅为 53.2%～57.7%，而AV1 基因编码的氨基酸序列同源性仅为 72.7%～77.9%。本研究从福建省的5个地市采集的番茄植株样品，都检测到番茄黄化曲叶病毒，该分离物的部分序列与从墨西哥锡那罗亚危害马铃薯的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-REP(C1)(登录号EU224315.1)的相似度最低，仅为97%，与国内其他省份的番茄曲叶病毒分离的相似度为98%～99%。福建省的番茄黄化曲叶病毒病与已报道的分离物相似度较高。由此可知番茄黄化曲叶病毒已在福建省的5个地市番茄生产区发生危害。

该病是一种检疫性病害，因此在生产要注意防止该病害的发生。①选择抗番茄黄化曲叶病毒品种。培育和选择抗黄化曲叶病毒且适合福建地区栽培的番茄品种是最有效科学的防治方法。已报道的抗番茄黄化曲叶病毒基因有5个，Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4及Ty-5[26-29]。育种学家们通过传统育种方法结合分子辅助育种方法选育出了一系列的番茄抗病品种。目前在福建省推广的适合福建地区栽培且抗TY病毒的品种有倍盈(先正达)、铁球3号(万农高科)、中厦A318 (中厦种籽)等。②培育健壮无病虫幼苗。于力等[30]研究结果表明番茄黄化曲叶病毒会通过嫁接的方式传播。福建省的番茄苗多为嫁接苗，因此在嫁接应当选择健康无病的接穗和砧木，注意嫁接刀的消毒。③加强田间管理。要注意整枝打杈等农事操作不可使用剪刀等工具，应当徒手进行，以避免人为传染病毒。如发现个别病株或疑似病株, 务必及时拔除深埋或焚烧，及时清除残枝落叶以减少虫源和毒源。该病毒主要是依靠烟粉虱持续传毒的，由此防治烟粉虱的传播是防治该病毒病的重中之重。化学防治：药剂可选用啶虫脒、扑虱灵或阿维菌素+噻嗪酮等。物理方法：黄板等。

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(责任编辑：林海清)

Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian

ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3,LI Da-zhong1,2,3，LIU Jian-ting1,2,3，LI Yong-ping1,2,3,DAI Chun-lan1,2,3,XUE Zhu-zheng1,2,3,KANG Jian-ban1,2,3,WANG Bin1,2,3,ZHU Hai-sheng1,2,3*

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China;2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013，China;3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

Molecular identification,variation, and phylogeneticity of the yellow leaf curl virus (TYLCV) on tomato plants in Fujian were investigated. For the study, specific primers were designed according to the known genome sequence of TYLCV for PCR detection. Then, the generated specific segments were collected, cloned and sequenced. A 541 bp fragment was obtained and its nucleotide sequence showed a high homogeneity, i.e., 97%-99%, with that of the tomato yellow curl leaf virus isolated from the domestic as well as international origins. It confirmed the presence of TYLCV infection on tomato plants in 5 cities in the province, and disease prevention and control measure should soon be implemented.

tomato;yellow leaf curl virus; identification

张前荣，温庆放，李大忠，等.福建省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定分析[J].福建农业学报，2016，31(6)：611-615.

ZHANG Q-R，WEN Q-F，LI D-Z，et al.Identification of Yellow Leaf Curl Virus on Tomato Plants in Fujian[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：611-615.

2016-01-07初稿；2016-04-28修改稿

张前荣(1987-)，男，硕士，研究实习员，主要从事蔬菜栽培与育种研究(E-mail：zhqrong@163.com)

朱海生(1978-)，博士，副研究员，主要从事园艺植物生理生化与分子生物学研究(E-mail:zhs0246@163.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1026-8)；国家大宗蔬菜产业体系项目(CARS-25-G-20);福建省科技重大专项(2013NZ0002-3)

S 436

A

1008-0384(2016)06-611-05