生防菌TB2对甘蔗叶片抗病相关酶活的诱导作用

梁艳琼，唐　文，吴伟怀，3，习金根，郑肖兰，李　锐，郑金龙，贺春萍*，易克贤*

(1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海南　海口　571101；2.海南大学环境与植物保护学院，海南　海口　570228；3.农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南　儋州　571737)



生防菌TB2对甘蔗叶片抗病相关酶活的诱导作用

梁艳琼1，唐文2，吴伟怀1，3，习金根1，郑肖兰1，李锐1，郑金龙1，贺春萍1*，易克贤1*

(1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海南海口571101；2.海南大学环境与植物保护学院，海南海口570228；3.农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站，海南儋州571737)

以多酚氧化酶 (PPO)、过氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)等5种防御酶作为植物抗病性反应指标，研究生防菌TB2和甘蔗赤腐病病菌对甘蔗植株抗病相关酶的影响。结果表明，先接病原菌后喷施生防菌TB2、先喷施生防菌后接病原菌、病原菌处理、生防菌处理等处理后，与植物防御抗病相关的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比对照组高，表明TB2和赤腐病菌均能诱导甘蔗叶片中的防御酶活性增强; 先喷施生防菌后接病原菌的防御酶活性比同期先接病原菌后喷施生防菌的高，说明TB2诱导能力强于赤腐病菌。两者共同处理的甘蔗叶片中 5种防御酶活性高于单独处理。可见 TB2和赤腐病菌共同诱导具有协同增效作用。

甘蔗，生防菌，防御酶系，诱导抗性

甘蔗SaccharumofficinarumL.是禾本科甘蔗属Saccharum植物，盛产于热带及亚热带，是世界和我国最为重要的糖料作物[1]。甘蔗赤腐病(镰型炭疽菌ColletotrichumfalcatumWent)是世界甘蔗生产过程中重要的病害之一。该病害不仅使产量减产，而且其病原菌还能促使蔗糖转化，从而降低蔗汁纯度和减少蔗糖糖分[2]。目前，国内外防治该病主要依赖抗病育种和化学防治，然而抗病品种培育不仅耗费时间长，而且易受病原菌小种变异而丧失抗病性[3-6]；化学药剂长期使用或使用不当，易导致病原菌抗药性，环境污染及农药残留等问题。近年来，生物防治由于其安全、低毒等特点已成为国内外的热点。诱导抗病性、溶菌作用、重寄生作用、竞争作用、抗生作用、交互保护作用等是生防菌防治植物病害的主要作用机制。植物对病害及其他逆境的抗性与多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等多种酶的活性变化有关[7-9]。近年来，很多学者对喷施生防菌后植物某些酶类及其代谢产物的变化与植物抗病性关系进行了广泛的研究。周登博[7]等利用6种饼肥基质拮抗菌发酵液通过灌根的方式施用于盆栽香蕉苗，以PAL、POD、SOD、PPO作为抗病性反应指标，检测不同基质的拮抗菌发酵液对香蕉枯萎病防病效果及抗病相关酶活性的影响。周林等[10]选择苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)等作为植物抗病性反应指标，采用灌根接种法，测定枯草芽孢杆菌TR21菌株发酵液不同组分对香蕉根系内3种酶活的影响。田昕[11]等定期采集田间对缩果病抗性不同枣树品种果实样本，测定POD、SOD、CAT、PAL等4种酶活性，分析其在枣果实发育过程中的变化规律与品种抗病性之间的关系。

有报道称Bacillus类细菌能够诱导寄主产生抗性，抵抗植物病害的侵染[12]。TB2是实验前期分离到的一株广谱抗真菌解淀粉芽孢杆菌，试验证明具有良好的定殖能力，盆栽条件下对甘蔗赤腐病具有一定的防控效果(另文发表)。目前，国内有关生防菌对甘蔗赤腐病防效的研究较少，关于生防菌对甘蔗植株抗病防御反应酶影响的研究尚未见报道，为此本研究选择PAL、POD、SOD、PPO、CAT作为抗病性反应指标，研究了生防菌TB2和甘蔗赤腐病对甘蔗植株抗病相关酶的影响，以明确 TB2对抗病防御酶的诱导机制，为甘蔗生产中合理利用TB2防治赤腐病和深入研究TB2的生防机制奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株解淀粉芽孢杆菌菌株(TB2)和甘蔗赤腐病菌菌株(SL121)均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定和保存。供试甘蔗种苗为桂蔗，选用大小基本一致的健康苗进行试验。

1.1.2培养基LB培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，琼脂 20 g，补充ddH2O至1 000 mL，pH 7.0(LB液体培养基则不加琼脂)。

PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖15～20 g，琼脂 15～20 g，补充ddH2O至1 000 mL。

1.2试验方法

1.2.1菌株的制备及接种将 TB2 菌株在 LB 平板中划线活化， 37℃恒温培养 24 h，得到活化的 TB2菌株单菌落，然后挑取单菌落接种于LB培养基中，37℃、200 r·min-1条件下振荡培养16 h即得 TB2种子液。按7%的接种量将解淀粉芽孢杆菌TB2 种子液接入 LB 培养基中，34℃，200 r·min-1，摇床培养48 h获得解淀粉芽孢杆菌TB2发酵液。活菌计数后用无菌水稀释至108cfu·mL-1的菌悬液备用。

将斜面保存的SL121菌株接入PDA平板上，置于28℃培养箱培养5 d，用5 mm打孔器打取菌饼，备用。

1.2.2TB2和SL121对甘蔗叶片抗性相关酶的诱导选择长势一致的植株，保持适宜温度和湿度，加强栽培管理。试验设5个处理，每个处理20株，重复3次。①先接病原菌后喷施生防菌(S+T)：将赤腐病菌SL121菌饼接入甘蔗叶片叶脉24 h后再喷施TB2；②先喷施生防菌后接病原菌(T+S)：将甘蔗叶片均匀喷施TB2 24 h后于叶脉处再接赤腐病菌SL121菌饼；③病原菌处理(S)：在甘蔗叶片叶脉上接入赤腐病菌SL121菌饼；④生防菌处理(T)：将生防菌TB2菌液均匀喷施甘蔗叶片；⑤空白对照(CK)：只喷施清水。分别于处理后24、48、72、96、120 h取甘蔗幼叶提取粗酶液。检测不同时间甘蔗体内相关防御酶的活性变化。

1.2.3叶片诱导抗性测定 取0.2 g甘蔗叶片用于提取粗酶，PAL、POD、SOD、PPO、CAT等酶活均按照酶活试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)步骤测定。

2　结果与分析

2.1对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

PAL活性测定结果表明(图1)，S+T、T+S、S和T等4个处理组的甘蔗叶片PAL活性均比对照处理高，空白对照甘蔗叶片的PAL活性活力最低，在24 ～120 h没有明显变化。T+S处理组甘蔗叶片中PAL活性明显高于其他4组处理，并在接种后的第48 h达到峰值，峰值达到81.49 U·g-1，随后下降并趋于平缓。S+T处理组的植株叶片PAL活力出现快速的增高，在第48 h达到高峰，随后活性逐渐降低。T处理组的PAL活性在96 h时达到峰值58.30 U·g-1。S处理组甘蔗叶片的PAL活性也有显著变化，在24～72 h时酶活性不断上升，在72 h时酶的活性为49.72 U·g-1，达到峰值。因此，TB2发酵液和赤腐病菌均能诱导甘蔗叶片中PAL的活性增强，且TB2发酵液诱导能力强于赤腐病菌，TB2发酵液和赤腐病菌共同处理的活性高于单独处理，可见 TB2和赤腐病菌共同诱导对PAL具有协同增效作用。

2.2对过氧化氢酶(CAT)活性的影响

测定生防菌及病原菌共同处理后甘蔗叶片中抗性防御酶CAT酶活性，结果如图2所示，T+S处理组中的CAT活性在24～120 h均显著高于其他4组处理，且在72 h时达到高峰，峰值为3 532.83 U·g-1。TB2发酵液单独处理甘蔗叶片CAT活性迅速增高，并在第72 h达到2 011.693 U·g-1峰值；S+T处理组CAT酶活在第96 h达到最高，峰值为2 767.96 U·g-1；S处理组中甘蔗叶片的CAT活性变化规律与S+T处理组CAT活性变化相似，在第96h达到高峰。4组处理组的CAT活性均高于空白对照，且两者同时处理比单独处理的CAT活性高。没有进行任何处理的空白对照CAT活性在120 h内变化不大。

2.3对过氧化物酶(POD)活性的影响

解淀粉芽孢杆菌TB2和甘蔗赤腐病菌SL121诱导甘蔗叶片过氧化物酶(POD)活性变化结果见图3，由图可知，各处理组呈先升高、后降低的变化规律，POD活性在24～48 h时急剧上升。T+S处理组的POD活性在第48h达到920.36 U·g-1峰值，S+T处理组、S处理组以及T处理组甘蔗叶片POD活性在第72h分别达到837.32、621.77、642.38 U·g-1峰值。与对照组相比POD活性显著增高，峰值高达对照组的2倍以上。对照组POD活性变化范围较小。比较5个处理组POD活性变化，结果发现，T+S处理组的酶活性显著高于其他3个处理组，诱导效果最佳。

2.4对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

SOD活性测定结果表明(图4)，T+S、S+T、S等3个处理组SOD活性变化明显，均表现为下降趋势，且在诱导后24h到达峰值，其中T+S处理组和S+T 2个处理组酶活分别为对照组的2.03倍和2.29倍，达到586.59、659.70 U·g-1，差异极显著。S处理组的酶活在峰值时为对照组的1.64倍，两者间差异显著。 T处理组的酶活在第96 h时达到388.10 U·g-1峰值，是对照组的1.35倍，差异显著。S处理组与T处理组在第96 h时两者差异不显著，但两者与其他处理组SOD酶活差异达到极显著。对照组的酶活变化不大，与其他4组处理SOD酶活差异极显著。

2.5对多酚氧化酶(PPO)活性的影响

测定解淀粉芽孢杆菌TB2和甘蔗赤腐病菌SL121对甘蔗叶片PPO活性的影响结果见图5，由图5可知，4组处理组PPO活性均呈现先增高后降低的趋势。对照组的PPO活力基本没有变化。接种病原菌后，PPO活力有明显提高，在第96 h达到高峰，峰值为91.33 U·g-1，S+T处理组的甘蔗叶片PPO活性先增加，在第96 h时达到峰值116.13 U·g-1，随后下降。喷施TB2的处理组PPO活性在第48 h达到峰值93.07 U·g-1，随后呈下降趋势，T+S处理组PPO活性出现峰值的时间与T处理组的时间一致，均是第48 h达到高峰。甘蔗叶片同时接种SL121和TB2的PPO活性比单独接种的PPO活性高，这些结果表明赤腐病菌侵染后, 施用TB2发酵液能诱导植物 PPO 酶活力进一步提高, 进而增强植物的抗病能力。

3　讨论与结论

刘朝辉等[13]利用哈茨木霉T23处理不同抗黄萎病类型的茄子苗，不同品种叶片内与抗病性物质合成相关的PAL、PPO、POD 和SOD 活性提高，说明茄子植株经过哈茨木霉T23诱导后，可以产生植保素、木质素等相关物质抵御黄萎病。刘淑宇等[16]通过测定绿色木霉发酵液对杧果果实炭疽病菌胞内抗性活性酶的影响证实，绿色木莓发酵液可抑制病原菌生长，并且会提高作物抗氧化酶的活性。张雨竹等[17]研究发现，桃色顶孢霉发酵液明显抑制镰刀菌的生长，大豆种子经浓度 10%至 80%桃色顶孢霉发酵液处理后，种子CAT 、POD、SOD 酶活性均明显增加。王淑霞等[20]等研究发现，哈茨木霉Tr-92处理黄瓜根部，黄瓜叶片的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性显著提高。本研究设计先接种SL121后喷施TB2、先喷施TB2后接SL121、仅接种SL121、仅喷施TB2等4个处理，测定其对甘蔗叶片的PAL、PPO、SOD、POD、CAT等活性的影响，结果发现，甘蔗叶片PAL、PPO、SOD、POD、CAT活性均显著提高，这与其他文献报道生防菌能够诱导植物抗病相关酶活的结果一致[14-20]。不仅验证了这些酶与植物抗病性密切相关，而且说明了盆栽接种TB2菌株对提高甘蔗多种防御酶活性，增强其抗病性具有良好的效果。

赤腐病菌从苗期到成熟期均可侵染甘蔗植株。目前防治该病主要以化学防治为主，但长期大量使用化学药剂使得抗药性不断增强，尤为严重的是，大量使用化学农药，农药残留易造成食品安全问题，同时会加剧环境污染。生物农药以其对人畜及生态环境无害的特点越来越受到人们的关注，而天然生防微生物以其独特的作用机理一跃成为生物农药发展热点。TB2是从植物叶片分离，安全可靠且不会对植物和环境造成污染的拮抗菌，本试验发现其能诱导甘蔗植株对赤腐病产生抗病性，因此，TB2是一株很有开发前途的生防菌。

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(责任编辑：黄爱萍)

Induction of Disease-resisting Enzymesin Sugarcane by Biocontrol Bacterium, TB2

LIANG Yan-qiong1,TANG Wen2,WU Wei-huai1,3,XI Jin-gen1,ZHENG Xiao-lan1, LI Rui1,ZHENG Jin-long1,HE Chun-ping1*,YI Ke-xian1*

(1.EnvironmentandPlantProtectionInstitute,CATAS/MinistryofAgricultureKeyLaboratoryforMonitoringandControlofTropicalAgriculturalandForestInvasiveAlienPests/HainanKeyLaboratoryforDetectionandControlofTropicalAgriculturalPests,Haikou,Hainan571101,China;2.CollegeofEnvironmentandPlantProtection,HainanUniversity,Haikou,Hainan5702283,China;3.OpeningProjectFundofKeyLaboratoryofRubberBiologyandGeneticResourceUtilization,MinistryofAgriculture/StateKeyLaboratoryBreedingBaseofCultivation&PhysiologyforTropicalCrops/DanzhouInvestigation&ExperimentStationofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,Danzhou,Hainan571737,China)

Activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), phenylalanine ammonia lyase (PAL), and catalase (CAT) in sugarcane leaves were determined to evaluate the efficiency of a biocontrol bacterium, TB2, in inducing these disease-resisting enzymes, as well as the correlation between the enzymes and the disease resistance of sugarcane toward red rot pathogens. Treatments, including pathogen inoculation,TB2 spraying, and TB2 sprayings before and after pathogen inoculation, were applied to examine the variations on the enzymatic activities in the leaves of the treated sugarcane plants.It was found that the enzymatic activities in the treated plants were significantly higher than those in control, indicating an induction effect byeither TB2 or the red rot pathogens. The effect was greater when TB2 was applied along with the pathogenic inoculation, especiallyif the leaves were pre-sprayed with TB2.Although the biocontrol bacterium showed a stronger induction ability than the pathogens, a synergism seemed evidentwhen both were present on sugarcane.

sugarcane; biocontrol bacteria; defensive enzymes; induced resistance

梁艳琼，唐文，吴伟怀，等.生防菌TB2对甘蔗叶片抗病相关酶活的诱导作用[J].福建农业学报，2016，31(6)：620-625.

LIANG Y-Q，TANG W，WU W-H，et al.Induction of Disease-resisting Enzymesin Sugarcane by Biocontrol Bacterium, TB2[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：620-625.

2016-03-07初稿；2016-04-25修改稿

梁艳琼(1985-), 女，助理研究员，研究方向：植物病理(E-mail: yanqiongliang@126.com)

贺春萍(1974-)，女，硕士，研究员，研究方向:植物病理(E-mail: hechunppp@163.com)；

易克贤(1964-)，男，博士，研究员，研究方向：分子抗性育种(E-mail: yikexian@126.com)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2015hzs1J014、2012hzs1J012、2014hzs1J012)； 中国热带农业科学院橡胶研究所省部重点实验室、科学观测实验站开放课题(RRI-KLOF201506)

S 476.1

A

1008-0384(2016)06-620-06