山西短颈剑线虫（Xiphinema brevicollum）形态与rDNA分子特征

霍世英，徐玉梅，高俊明＊，王建明，赵增旗

（1.山西农业大学农学院，太谷 030801；2.新西兰皇家研究院土地环境研究所，奥克兰 1072）

剑线虫属（XiphinemaCobb，1913）隶属于矛线目（Dorylaimida），长针科（Longidoridae），剑亚科（Xiphinematinae）。剑线虫作为一类重要的植物外寄生线虫，可寄生于植物根部，影响根系长势，甚至造成根部肿大或坏死等症状。美洲剑线虫组（Xiphinemaamericanumgroup）属于剑线虫属，在我国北京、山东、浙江等多省市都有报道，为我国分布最广泛的剑线虫属内种群，但美洲剑线虫组内部分种间的差异非常小，甚至交叉重叠，rDNA 序列的相似性很高，其有效种数量存在争议，如Lamberti等［1］认为有49个有效种，Luc等［2］认为有34 个有效种。1998 年Luc等［2］在排除了地理因素后认为X.brevicollum与X.incogitantum、X.parvum、X.sheri、X.taylori、X.pseudoguirani几个种之间形态学差别甚微，其形态测量数据存在明显的重叠，都应归X.brevicollum的二级同物异名，其形态学偏差属于种内变异。Luc等［2］进一步指出，X.brevicollum是孤雌生殖的种，其各个群体其实为一个克隆或若干克隆的混合体，再加上其广泛的地理分布，群体间存在较大的变异是很正常的。在山西境内尚未有X.brevicollum的报道，本文在山西太谷采集的线虫样品中，对分离到的剑线虫进行了形态观察和测量，并对rDNA-ITS1、rDNA-ITS2和28S序列进行了扩增、测序及系统进化分析。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和线虫的分离

采集地点：山西省太谷县山西农业大学校园内，在一株枝叶枯黄的松树根际距地表5～30cm 深处挖取土壤500g左右放入塑料袋中混匀封口，标明采样地、采样时间、寄主植物等，带回实验室，4 ℃下保存，用于线虫分离鉴定。采用浅盘分离法分离线虫：在塑料筐里均匀铺两层纸巾，再用电子秤称取100g土样，均匀铺在塑料筐中的纸巾上面，将塑料筐放在浅盘中，往浅盘中加入400mL 水，放置48h后倒掉塑料筐中的土样，将浅盘中的线虫悬浮液倒入600目孔筛，筛掉线虫悬浮液中多余水分，至筛中剩余悬浮液约30～50mL，转移至50mL的试管中，静置3h备用。

1.2 线虫形态鉴定

参照武扬等的方法［3］。

1.3 线虫DNA的提取

参照Wu等的方法［4］略作改进。用移液枪吸取10μL ddH2O 放入0.2mL PCR 管中，用挑针挑取单条线虫放入其中，加入含8μL WLB 液（含125 mmol／L KCl，25 mmol／L Tris-HCl，pH 8.3，3.75 mmol／L MgCl2，2.5mmol／L DTT，1.125%Tween 20）管中，并向管中加入2μL 蛋白酶K（600μg／mL）。混匀后，将管放入-70 ℃冰箱过夜，次日转入PCR 仪，65 ℃孵育1h、95 ℃10 min。最后经14 000r／min离心1min，即得粗提DNA 的悬浮液。其上清即可直接用于PCR 扩增或者于-20 ℃下保存备用。

1.4 分子检测

①PCR 反应体系：在0.2mL PCR 管中分别加入10μL mix（2×Taqpolymerase，2×PCR buffer，2×dNTPs），6μL ddH2O，10μmol／L 的上下游引物各1μL，线虫粗提DNA 2μL。

②ITS1区扩增：以粗提DNA 悬浮液的上清为模板，采用通用的上游引物 V1（5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和下游引物V4（5′-ACGAGCCGAGTGATCCACCG-3′）［5］。扩增程序为95 ℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃90s，35个循环；72 ℃5min；4 ℃保温.

③ITS2区扩增：以粗提DNA 悬浮液的上清为模板，采用通用的上游引物V1，下游引物V2（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）［5］。扩增程序为95℃4min；95℃30s，52℃30s，72℃90s，35 个循环；72 ℃5min；4 ℃保温。

④28S区扩增：以粗提DNA 悬浮液的上清为模板，采用通用的上游引物D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′）［6］，下游引物D3B（5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′）。扩增程序为94℃4 min；94℃45s，53℃1min，72℃2min，35 个循环；72℃10min；4℃保温。

⑤构建贝叶斯系统发育树：取5μL PCR 反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳（100V，100mA）分离。电泳后经EB 染色，紫外检测仪上观察记录和拍照。由上海生工生物技术公司进行测序，测序结果经人工校对后与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST 比较，并从数据库获得相关种属序列，构建贝叶斯系统发育树。

2 结果与分析

2.1 山西短颈剑线虫的形态分析

显微观察结果见图1a～h。雌线虫经热杀死后呈腹面弯曲的“C”形，体长1.71～2.26mm，两端渐细。唇区圆形，缢缩明显，高度为（3.7±0.6）μm（2.3～5.2μm），侧器孔为马鞍状；齿尖针细长、高度硬化，长度为（87.0±3.3）μm（76.2～105.3 μm）；齿针导环为双环，后环高度骨化，后导环到前端距离为（72.3±2.1）μm（64.4～78.0μm）；齿尖针基部呈叉状，齿托基部呈显著的凸缘状，凸缘处体宽为（35.8±2.7）μm（30.5～42.4μm）；阴门位于体长中间偏上，子宫内无特殊分化，生殖腺对生、均发育完全，生殖腺较短、前后卵巢长度相等。尾短圆锥形，有轻微指状突起，尾长略长于肛门处体宽。未见雄虫。

图1 山西短颈剑线虫雌虫的形态特征Fig.1 The morphological characteristic of Xiphinema brevicollumfrom Shanxi Province

雌线虫的形态测量值见表1，根据Loof等［7］多歧检索表，从山西太谷县松树根际得到的剑线虫特征代码为A2-B？-C3-D5／（6）-F2-G1-H2-I4，该虫被鉴定为X.brevicollum。

表1 山西短颈剑线虫的形态测量值1）Table 1 The microscopic measurement of Xiphinema brevicollumfrom Shanxi Province

续表1 Table 1 （Continued）

2.2 分子生物学特征

利用MrBayes 3.1.2 软件对该线虫的ITS1、ITS2和28SRNA 基因中的D2D3区序列构建贝叶斯系统发育树进行进化分析。

（1）ITS1 区分子生物学特征：通过GenBank中BLAST比对可知太谷县松树根际的Xiphinema分离物ND-46 与AY359856（X.brevicollum）、FM211422（X.brevicollum）、AY359858（X.diffusum）、AY430190（X.brevicollum）和FM211425（X.brevicollum）的相似性在94%以上，在贝叶斯系统发育树（图2）上ND-46与FM211422（X.brevicollum）、FM211425（X.brevicollum）、AY359858（X.diffusum）、AY430190（X.brevicollum）在同一分支上，证实了Luc等［2］的观点，即X.diffusum为X.brevicollum的同物异名，所以根据比对和进化分析可以得出ND-46为X.brevicollum。

图2 基于rDNA-ITS1区序列的剑线虫属贝叶斯系统发育树Fig.2 The Bayesian tree based on rDNA-ITS1region of the genus Xiphinema

（2）ITS2 区分子生物学特征：经BLAST 比对可知，太谷县松树根际的Xiphinema分离物ND-46与JX218046（X.brevicollum）和FM211420（X.brevicollum）相似性在94%，在贝叶斯系统发育树（图3）可以看到ND-46与JX218046（X.brevicollum）亲缘关系最近，在同一分支上，因此可以得出ND46为X.brevicollum。

（3）28SRNA 基因中D2D3区分子生物学特征：在BLAST比对发现ND-46与KF430800（X.brevicol-lum），HM163210（X.inaequale），AY601601（X.brevicollum）的相似性在99%，在贝叶斯系统发育树（图4）上它们也都在同一支上，亲缘关系很近。从比对与进化分析可以进一步得出ND-46为X.brevicollum。

图3 基于rDNA-ITS2区序列的剑线虫属贝叶斯系统发育树Fig.3 The Bayesian tree based on rDNA-ITS2region of the genus Xiphinema

图4 基于28SRNA基因D2D3区的剑线虫属贝叶斯系统发育树Fig.4 The Bayesian tree based on D2D3region of 28SRNA gene of the genus Xiphinema

3 讨论

剑线虫属是线虫门中种类最多的一个属，其分类方法繁多，但剑线虫属内种的多歧检索表得到了全世界的普遍接受。基于Loof等［7-11］多歧检索表，从山西太谷松树根部得到的剑线虫特征代码为A2-B？-C3-D5／（6）-F2-G1-H2-I4，但是据 Lamberti等［12］的统计，在美洲剑线虫组内已被描述的组内种有49个，其形态特征十分相似，也没有明显的种间差异，在剑线虫属形态分类多歧检索表中［6］它们应用相同的鉴定代码，很难将其依据形态区分。

剑线虫的鉴定目前普遍采用的方法是rDNARFLP。Vrain等［5，13］应用此方法区分了16个美洲剑线虫群体rDNA 中ITS 区的特征；Knoetze等［14］和Ni等［15］运用rDNA-RFLP方法分别鉴定了南非和中国台湾的一些剑线虫属群体。随着剑线虫属分子分类研究的不断丰富，利用某些基因区段特别是rDNA 的分子系统发育分析的研究越来越引起线虫界的普遍接受［16-18］，基于rDNA-ITS、D2D3序列构建的系统发育树不仅从一定水平上揭示了剑线虫属的美洲剑线虫组Xiphinemaamericanumgroup内种群间的亲缘关系及与其他种间关系，也从另外一个角度证明了在山西太谷松树根际得到的剑线虫与X.brevicollum亲缘关系较近。

基于形态特征与贝叶斯系统发育树的双向研究表明：在山西太谷县松树根际发现的这一美洲剑线虫为X.brevicollum。

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