早实薄皮核桃根际与非根际土壤微生物多样性分析

刘丽丽，李建辉，郑雪良，陈骏，杨海英，王登亮

(1.衢州市农业林业科学研究院 果树研究所，浙江 衢州 324000；2.衢州学院 环境工程系，浙江 衢州 324000)

核桃(Juglansregia)位列世界四大干果之首，属于胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)落叶乔木，素有“木本油料之王”的称号，是我国主要的经济树种之一，具有极高的营养价值和良好的医疗保健效果[1]。近年来，早实薄皮核桃因其具有显著区别于普通核桃的优良性状而广泛受到种植主体的欢迎，栽培面积不断扩大。在早实薄皮核桃引种与推广过程中，如何提高品质和产量一直是人们关注的焦点。从已有的研究来看，其产量的高低、品质的优劣与土壤立地条件密切相关[2-3]。然而，对早实薄皮核桃土壤立地条件已有的研究主要关注其土壤理化性质，对土壤微生物的研究迄今未见报道。

微生物是根际土壤的重要组成部分，与植物生长密切相关。根际土壤微生物会受到植物根系分泌物的影响，但其种类组成和多样性也会影响植物的生长发育状况，甚至决定植物的产量与品质[4]。有研究表明，根际土壤微生物群落结构失调会导致病原菌数量的增加，从而直接影响植株生长发育[5-6]。因此，了解早实薄皮核桃根际微生物群落结构和多样性的变化，对评价土壤微生物对早实薄皮核桃的生长和品质的影响具有重要意义。为此，本文以浙江省衢州市引种的早实薄皮核桃为研究对象，基于Illumina MiSeq高通量测序技术，对早实薄皮核桃根际与非根际土壤微生物多样性进行研究，探讨两者之间的区别，为进一步研究早实薄皮核桃的根际效应提供基础数据，也为早实薄皮核桃的健康生长及在各地的引种与推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

早实薄皮核桃根际与非根际土壤样品采集于衢州市农业林业科学研究院果树所试验基地，引进的品种为8518。选择建园3 a、栽培管理措施相同、长势基本一致的3株早实薄皮核桃，每株在距离树干基部50 cm处随机选取3个取样点并混合后用于分析。采用内径为10 cm的土钻采集0～30 cm土层的样品，收集直径为0.1～0.5 cm的细根，用1 mm土壤筛经抖动法获取根际土壤样品。同时，在同一地块中未种植薄皮核桃植株的空地上，采用“Z”字形方法随机采集3份非根际土壤。将土壤样品装入已消毒密封塑料袋中带回实验室，置于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2 基因组DNA的提取和测序

采用OMEGA试剂盒提取土壤微生物基因组总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳并利用核酸定量分光光度计(NanoDrop，美国)检测合格后置于-20 ℃保存备用。由杭州沃森生物公司通过Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。细菌扩增引物为B341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和B785R(5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)；真菌扩增引物为ITS-3(5′-GATGAAGAACGYAGY RAA-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)。

1.3 数据分析

采用DPS统计软件进行数据处理与分析，利用Duncan新复极差法(LSR)进行差异显著性检验。在97%相似水平上对可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)进行分类分析，并在不同分类水平上统计种类组成。采用ACE指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数计算微生物多样性[7-8]。使用Blast在NCBI数据库(https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)进行比对，将优化序列根据数据库中的参考序列在门、纲、目、科、属的水平上进行鉴定，比较分析其种类组成和丰度。

2 结果与分析

2.1 根际与非根际土壤微生物质量

通过Illumina MiSeq高通量测序获得了早实薄皮核桃根际与非根际土壤细菌和真菌群落的优化序列及其OTUs的信息(表1、表2)。双端序列(reads)拼接和过滤后，共得到早实薄皮核桃根际与非根际土壤细菌和真菌分别为48 065和78 807条优化序列，其中根际土壤细菌和真菌分别为24 700和42 088，非根际土壤细菌和真菌分别为23 365和36 719，根际土壤细菌和真菌序列数分别比非根际土壤多1 335条和5 369条。基于大于等于97%的相似度水平，通过聚类分析细菌共获得3 355个用于物种分类的OTUs，根际和非根际OTUs数量分别为1 718和1 637，两者差异不显著；真菌共获得859个用于物种分类的OTUs，根际和非根际OTUs数量分别为489和370，两者差异显著。早实薄皮核桃根际土壤中细菌和真菌的OTUs数量均大于非根际土壤，表明与非根际土壤相比，根际土壤中细菌和真菌的物种更加丰富。

2.2 根际与非根际土壤细菌多样性

2.2.1 细菌种类组成

早实薄皮核桃根际与非根际土壤中细菌相对丰度排名前3的门分别为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)，其中放线菌门在根际与非根际土壤中的相对丰度均达到30%以上；在纲分类水平上，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中均以放线菌纲的相对丰度最高，根际为36.62%，非根际为37.95%；从目分类水平来看，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中均以放线菌目的相对丰度最高。

2.2.2 细菌多样性

从细菌多样性分析结果来看(表1)，根际土壤和非根际土壤中测序覆盖率均达97%以上，表明两者测序的结果都可以反映其真实情况。生物多样性指标中Shannon指数、Chao1指数和ACE指数的数值越大，说明被测样品多样性越高；而Simpson指数值越小，则说明生物多样性越高。从表1可以看出，两者的Chao1指数和ACE指数值都比较大，表明两者的细菌丰富度都比较高，但两者之间的差异未达到显著水平；根际与非根际土壤Simpson指数相等，根际的Shannon指数略高于非根际，但两者差异不显著。由此可知，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中细菌丰富度总体较高，但两者的多样性未存在显著差异。

表1 早实薄皮核桃根际与非根际土壤细菌多样性指数

2.3 早实薄皮核桃根际与非根际土壤真菌多样性

2.3.1 真菌种类组成

早实薄皮核桃根际与非根际土壤中真菌相对丰度均以子囊菌门最高，其中根际土壤达89.67%，非根际土壤达89.42%。在纲分类水平上，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中均以粪壳菌纲的相对丰度最高，其中根际土壤为53.65%，非根际土壤为30.40%。从目分类水平来看，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中均以肉座菌目相对丰度最高。从科分类水平来看，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中均以蜜环菌科的相对丰度最高。

2.3.2 真菌多样性

从真菌多样性分析结果来看(表2)，根际土壤和非根际土壤测序覆盖率均达到99%以上，表明两者测序的结果都可以反映其真实情况。在各项多样性指数来看，Chao1指数和ACE指数均为根际土壤大于非根际土壤，且两者差异显著，表明根际土壤真菌丰富度大于非根际土壤；根际土壤真菌Shannon指数大于非根际土壤，而Simpson指数为根际土壤小于非根际，且两者之间的差异均达到显著水平。由此可见，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中真菌多样性存在显著区别，根际土壤真菌多样性大于非根际。

表2 早实薄皮核桃根际与非根际土壤真菌多样性指数

3 讨论

与其他环境中生存的微生物相比，土壤生境中的微生物往往有着更高的物种丰富度和更复杂的群落组成，但根际土壤与非根际土壤往往有所区别[9]。有研究发现，土壤本身的理化性质和植物种类都能够直接影响微生物的群落结构和多样性[10-11]。本研究通过Illumina MiSeq高通量测序平台对早实薄皮核桃根际与非根际土壤进行了宏基因组测序，获得细菌和真菌序列。结果发现，早实薄皮核桃根际土壤细菌和真菌序列数分别比非根际土壤多1 335条和5 369条，根际土壤中细菌和真菌的OTUs数量均大于非根际土壤，这与李小林等[12]的研究结果基本一致。从Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数来看，早实薄皮核桃根际土壤中的真菌多样性均显著高于非根际土壤，但细菌多样性之间差异不显著，这可能是由于早实薄皮核桃根系分泌的某些化学物质是土壤的其他理化性质引起的，还需通过进一步试验深入研究加以证实。

另一方面，根际土壤微生物群落结构与土壤健康状况密切相关，其对植物的生长发育、抗逆能力、产量和质量等都会产生重要影响，根际土壤微生物群落结构失衡是引发病害的重要原因，因此，了解根际土壤微生物群落结构可为维护植物-土壤-微生物生态系统的相对稳定性提供重要参考[13]。本研究结果表明，早实薄皮核桃根际与非根际土壤中的真菌在门分类水平上均以子囊菌门占优势地位，这与付亚娟等[14]对大花杓兰的研究结果相似。从已有的研究来看，子囊菌门的某些微生物能够改善植物的抗菌、抗氧化的作用，可增加植物的生物量，提高植株的抗病性，促进植株的生长[15]。本研究结果可为早实薄皮核桃的健康生长及引种和推广提供理论依据。