卷丹百合体外对肺腺癌A549细胞抑制作用的实验研究*

艾庆燕 赵豫凤 王爱红 杨加周 王艳梅

延安大学医学院(延安 716000)

卷丹百合体外对肺腺癌A549细胞抑制作用的实验研究*

艾庆燕 赵豫凤△王爱红 杨加周 王艳梅

延安大学医学院(延安 716000)

目的：研究百合对肺腺癌细胞株A549增殖作用的影响及其相关机制。方法：体外培养肺腺癌细胞株A549，用不同浓度的百合水提物分别作用于对数期生长的A549细胞24、48和72 h，MTT(甲基噻唑基四唑)比色法检测百合对A549细胞增殖的抑制率，碘化丙啶(PI)染色，荧光显微镜下观察细胞形态改变及凋亡情况。结果：MTT法检测结果显示，百合水提物在1～8mg/mL浓度范围内、24～72h 时间范围内对A549的生长有明显抑制作用，且呈浓度和时间依赖关系(P<0.05)；PI染色荧光显微镜观察显示百合作用48h后，细胞出现凋亡的形态学改变。结论：百合具有体外抑制肺腺癌细胞株A549增殖的作用，其可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抑制A549细胞增殖的作用。

肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一[1]，其中75%～80%是非小细胞肺癌，其虽对放、化疗敏感，但化疗药物毒副作用较大，且易产生耐药和出现复发、转移。从植物来源的化合物在治疗癌症中具有多方位、多靶点、不易产生耐药性等优势，符合肿瘤多因素、多环节致病的机理，对植物性药物抗肿瘤有效部位、有效成分及作用机理的研究目前已成为国内外研究热点。百合(Lilium spp.)是多年生宿根草本植物，国内外学者对百合的化学成分提取、生物活性物质、产品加工及应用等方面进行了大量研究。现代医药学研究证实百合具有止咳化痰、抗疲劳、耐缺氧、降血糖、抑制迟发性过敏反应、催眠安神、抗癌等功效[2]。本实验应用体外培养的人肺癌A549细胞株，探讨卷丹百合活性成分对A549细胞增殖的影响，为阐明百合的抗肿瘤机制及临床应用提供新的治疗思路和实验依据。

1 实验材料 主要试剂及材料 实验用人肺癌细胞株A549由延安大学医学实验中心液氮保存。卷丹百合由西北农林大学林学院提供。细胞用RPMIl640培养基、胎牛血清( FCS)及细胞消化液胰酶(Tyrisin)均购自美国Gibco BRL公司；碘化丙锭( PI)、二甲基亚砜( DMSO)、MTT 等购于美国sigma公司。荧光倒置显微镜采用Nikon显微镜，酶标仪采用美国Bio-Rad 680 型全自动酶标仪。

2 实验方法 2.1 细胞复苏培养 从液氮中取出冻存保种的细胞株，迅速置于37℃水浴融化，用培养基洗涤1次。A549细胞常规培养于37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，培养基为RPM I-1640，含10%新生牛血清、1%双抗(青霉素、链霉素) ，2～3d传代1次，取对数生长期细胞应用于实验。

2.2 卷丹百合活性成分的提取 卷丹百合球根鳞片在60 ℃下烘干，粉碎成粉末备用。称取5 g百合球根干粉，置于三角瓶中，加入150 mL去离子水，70℃超声提取40min，重复1次，过滤并将滤液蒸发干，配制50mg/mL的溶液备用。

2.3 MTT 法测细胞增殖率的变化 收集对数生长期A549细胞，制成单细胞悬液，以1×105/mL的密度接种于96 孔板，每孔100μL，在5% CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁后，吸出培养液，加入百合水提物，药物浓度分别为1、2、4、8mg/mL，每组设6个复孔，加药后分别培养24、48、72 h后，每孔加MTT溶液( 5 g /L) 20μL，37℃继续培养4 h，吸净含MTT的培养液，加入二甲亚砜( DMSO) 150μL/孔，振荡10 min，使MTT还原产物甲臜完全溶解，用酶标仪(波长490 nm )测定每孔的光密度(OD值)，取平均值计算抑制率。以空白细胞组为对照，其细胞存活率为100%，计算处理后细胞的生存率。细胞生长抑制率(% ) = (1-实验组OD值/对照组OD值)×100 %。

2.4 PI染色法观察肺癌细胞的形态变化 A549细胞生长至对数生长期时，调整细胞密度为2×104～2×105个/mL，接种于6孔培养板，每孔2mL，待细胞生长密度达到80%的融合时，加入卷丹百合水提物，浓度分别为2、4、8mg/mL作用于培养的肿瘤细胞，培养时间为48h，重复三次，光镜下观察细胞形态改变，然后以1 000 r /min 离心5 min，弃去培养液，2mL PBS 洗1次，加入50 mg /mL的碘化丙啶(PI)染料，避光染色30 min，荧光显微镜观察细胞形态改变并拍照。

3 实验结果3.1 百合对A549细胞增殖抑制作用 MTT结果显示百合在1～8mg/mL浓度范围内能明显抑制体外培养的A549细胞生长，并呈现出时间和浓度的依赖性。随着用药时间延长，抑制率明显上升(P<0.05)。相同作用时间下，随着药物浓度的增加，其对A549抑制作用越明显 (P<0.05，见表1)。

表1 不同浓度百合对A549的影响(±s)

注：△与对照组比较P<0.05；▲与对照组比较P<0.01

3.2 显微镜下观察百合对A549细胞生长的抑制 光镜下观察发现不同浓度的百合作用48h后A549细胞形态发生了明显的改变。用PI 染色后倒置荧光显微镜下观察，空白组的A549细胞呈现梭形，轮廓清晰，细胞密度大；不同浓度的百合作用48h 后的细胞与对照组相比较发生明显的形态改变 (见图1)，A549细胞皱缩、轮廓模糊，细胞密度明显降低，细胞间隙增大，并出现大量凋亡细胞，胞核浓缩、裂解；尤其8mg/mL浓度的百合作用后细胞呈圆团形，细胞核聚集成团块状。

图1 不同浓度百合作用48h 后A549细胞生长的PI染色显微图(×200)

A:空白对照组； B:2mg/mL的百合作用后的细胞；C:4mg/mL的百合作用后的细胞；D:8mg/mL的百合作用后的细胞。

4 讨 论 肺癌生物学特性十分复杂，恶性程度高，目前肺癌的早期诊断比较困难，约70%患者在确诊时已属Ⅲ-Ⅳ期，且发病率逐年上升，临床多采用以化疗为主的综合治疗方法，毒副作用大。寻找毒副作用小的抗肿瘤药物是目前整个医学界的一大课题，目前国内外抗肿瘤药物研究的一个重要方向是从天然产物(植物或中草药)提取具有毒副作用小的治疗恶性肿瘤的成分[3,4]。我国是应用和栽培百合最早的国家，中药百合始载于《神农本草经》，百合肉质鳞茎的鳞片，性味甘寒，有养阴清肺、清心安神之功，具有较好的药用价值和保健功能。近年来对百合的化学成分、药理作用、临床应用方面已做了大量研究，发现百合球茎中含有多种生物活性成分，如多糖、甾体皂甙及类黄酮、有机酸、蛋白质、维生素、生物碱、磷脂、无机元素、膳食纤维等物质。

本研究MTT结果表明，百合在体外对人肺癌细胞株A549有明显的抑制作用，且呈剂量依赖和时间依赖性，尤其8 mg/mL的百合作用72 h 后，对肺癌细胞抑制率可高达54.56%，由于本研究采用的是百合的粗提取物，说明百合的多种生物活性成分具有抑制癌细胞增殖的作用。百合中的甙类为甾体皂苷，根据甙元结构的不同，可将其归纳为螺甾皂苷、异螺甾皂苷、呋甾皂苷、变形螺甾烷皂苷四大类，从百合中分离得到的甾体类化合物共有47个[5]，百合皂苷及其衍生物能抑制TPA 刺激的宫颈癌细胞，并抑制各种人类恶性肿瘤细胞，如胰腺癌、骨肉瘤、嗜铬细胞瘤等[6]。有研究表明白首乌甾体皂苷类成分K1N可通过阻滞A549肺癌细胞进入G2/M期，抑制肺癌细胞的生长增殖，C1N、C2N将肺癌细胞阻滞在G0/G1期，阻止受损细胞进入S期进行DNA合成而抑制肺癌细胞的过度增殖[7]。所以笔者推测百合皂苷具有抗肿瘤、抗癌活性，并且其可以抑制肺癌细胞的增殖生长。百合含秋水仙碱能抑制癌细胞的增殖，作用机理是抑制肿瘤细胞的纺锤体，使其停留在分裂中期，不能进行有效的有丝分裂。多糖成分抗肿瘤活性的作用表现为提高宿主免疫功能，也有对肿瘤细胞直接杀伤和抑制的作用。纯化百合多糖能抑制H22小鼠肝癌生长，同时能增强荷瘤小鼠的免疫功能[8]。LBPS-I多糖对移植性黑色素B16和Lewis肺癌有较强的抑制作用。百合中的多种活性成分可能作用于癌细胞的不同阶段，使细胞生长所需要的DNA、RNA、蛋白质合成受到严重阻碍，或破坏癌细胞膜，引起肺癌细胞死亡。

凋亡是受基因调控的细胞程序性死亡，肿瘤细胞的凋亡受到许多凋亡调控基因及酶的影响，细胞增殖过度，凋亡受阻是恶性肿瘤的重要生物学特征之一。黄酮类化合物抗肿瘤通过抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，干扰肿瘤细胞信号转导和控制基因表达以及抑制血管生成等体现[9]。黄酮类化合物可以激活乳腺癌细胞中的DCL肿瘤抑制基因，抑制细胞增殖，使细胞周期停滞在G2-M，进而诱导p21Waf1基因表达，引起肿瘤凋亡，还能通过抑制细胞信号转导过程中关键酶的活性，作用于肿瘤细胞[9]。本实验中百合作用48h后的肿瘤细胞，经PI染色荧光显微镜观察发现细胞发生了明显的形态改变，细胞形状模糊，细胞间隙增大，出现了凋亡细胞形态的改变。说明百合可以诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，这可能是百合抑制人肺腺癌A549细胞增殖的另一机制。

百合是卫生部审批通过的首批药食两用品之一，是一疗效确切安全可靠的防病治病之品，其特点是来源广泛、价格低廉、不良反应轻。百合抗瘤机制与传统化疗药有着完全不同的特点，并可与其他抗癌药协同增效，因此在确定其抗癌活性的基础上，其作用机制值得进一步深入研究，随着科学技术的进步和对百合成分的深入研究，有望获得低毒并具有明确抗肿瘤作用和机制的抗癌药物，将具有良好的发展前景。

[1] 张媛媛，吕喜英.索拉非尼对人肺腺癌细胞株A549抑制作用的研究[J].临床肺科杂志，2011，16(5)：728-729.

[2] 车景超，丰 杰，辛 宁. 卷丹和百合化学成分与提取方法研究进展[J].时珍国医国药,2008, 19(6):1500-1501.

[3] Kado K, Forsyth A, Patel PR, et al. Dietary supplements and natural products in breast cancer trials[J]. Front Biosci,2012,4:546-67.

[4] Qurishi Y, Hamid A, Majeed R, et al. Interaction of natural products with cell survival and signaling pathways in the biochemical elucidation of drug targets in cancer[J].Future Oncol.2011,7(8): 1007-21.

[5] 高淑怡，李卫民，帅 颖，等.药用植物百合甾体皂苷研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18 (16):337-341.

[6] 高淑怡，李卫民，帅 颖，等.药用植物百合甾体皂苷研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012，18 (16):337-341.

[7] 姚 楠，顾晓洁，李友宾.白首乌中3个C21甾体皂苷类成分对人肺癌A549细胞生长及周期的影响[J].中国中药杂志,2009,34 (11 ):1418-1420.

[8] 弥 曼，李 汾，任利君，等. 百合多糖的分离纯化及抗肿瘤作用[J].西安交通大学学报(医学版)，2009,30(2):177-180.

[9] 张秀莉，王春明，雷旭东. 黄酮类化合物的抗肿瘤活性及其机制研究进展[J].甘肃医药，2011,30(4):205-207.

(收稿2014-11-15；修回2014-12-11)

Depressant effects of Lilium lancifolium on human pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Ai Qingyan Zhao Yufeng Wang Aihong et al

Objective：Investigate the effects of Lilium lancifoliumon inhibition of pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro and explore its mechanism．Methods：The A549cells in vitro were treated with Lilium lancifolium at different concentrations to 24h,48h and 72h respectively. MTT assay was used to examine the proliferation．PI staining were used to observe the morphological changes of cancer cells．Results：The depressant effects of Lilium lancifolium on human A549were determined by MTT assay after at 24h, 48h and 72h.The concentration of Lilium lancif olium was 1～8mg/mL. Lilium lancifolium could obviously inhibit proliferation of A549cells, the effect was a time-dose-dependen tmanner(P<0.05). Pl Fluorescence microscope indicated that apoptotic change was observed in A549cells after treatment with Lilium lancifolium for 48h. Conclusion：Lilium lancifolium can inhibit the growth of A549cells remarkably by inducing apoptosis and blocking cell cycle．

Lung Neoplasms/experiment research Apoptosis @Lilium

*延安市科技项目 (2013-kw03 )

肺腺癌/实验研究 细胞凋亡 @百合

R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.051

△通讯作者