硝菔通结方对便秘大鼠血清5-HT和结肠组织AQP3的影响*

满思艺 谢 培 王郁金 周永学

陕西中医学院 (咸阳712046)

·实验研究·

硝菔通结方对便秘大鼠血清5-HT和结肠组织AQP3的影响*

满思艺 谢 培 王郁金 周永学△

陕西中医学院 (咸阳712046)

目的：观察硝菔通结方对便秘模型大鼠血清5-HT和结肠组织AQP3表达的影响，揭示该方治疗便秘的作用机制。方法：将50只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、硝菔通结方低、中、高剂量组。除正常组外，其余各组大鼠以15mg/kg复方地芬诺酯混悬液灌胃28 d，复制便秘模型。模型成功后，分别给药21d，后取血清和结肠组织，ELISA法检测血清5-HT含量，Q-PCR法检测结肠组织AQP3的mRNA表达。结果：模型组的大鼠血清中5-HT含量与正常组比较明显升高(P<0.05)；药物治疗后，各治疗组血清中5-HT含量均降低(P<0.05)，其中硝菔通结方高剂量组最为显著(P<0.01)；模型组结肠组织中AQP3与正常组比较表达升高(P<0.05)，各剂量的硝菔通结方治疗组均降低了结肠组织中AQP3的表达，其中硝菔通结方高剂量组最为明显(P<0.05)。结论：硝菔通结方可通过降低血清5-HT含量和降低结肠组织AQP3的表达从而促进肠道动力和调节肠道水液代谢，对功能性便秘发挥治疗作用。

功能性便秘是以排便次数减少、粪便量减少、粪便干结、排便费力等为表现的临床常见病，并且随着年龄增加，便秘的发生率和严重程度也会随之增加[1]。便秘已成为严重影响现代人生活质量的疾病严，并且易诱发结肠癌、心脑血管意外等疾病[2]。硝菔通结方是在清代著名医家张锡纯所创名方“硝菔通结汤”的基础上，根据功能性便秘常以肾虚为主的特点，加入了助阳通便的肉苁蓉和润肠通便的当归。全方由芒硝、莱菔、肉苁蓉、当归组成，用于治疗肾虚肠燥型便秘临床疗效确切，但该方的作用机制目前尚不十分清楚。而现代研究表明，功能性便秘的发生于肠道动力失常和水液代谢紊乱密切相关，而肠神经递质5羟色胺(5-HT)和水通道蛋白3(AQP3)与肠道动力和水液代谢密切相关[3-5]。因此本实验通过观察硝菔通结方对功能性便秘大鼠体内5-HT及AQP3的影响，为该方的临床应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 动物 选用成年雄性SD大鼠50只，体重200～250g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2012-003。适应性饲养一周后进行实验，自由摄食及饮水。

1.2 主要试剂和仪器 大鼠5-HT Elisa检测试剂盒：批号：23007331；上海西唐生物技术有限公司； EasyPure RNA Kit：批号：ER101-01H30716Q046，北京全式金生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒、Q-PCR试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司; AQP3引物的设计与合成：南京金斯瑞生物科技有限公司；PCR仪EDC-810型：北京东胜创新生物科技有限公司；核酸测定仪，型号：NANODROP2000C，Thermo(美国)公司；高速分散器(内切式匀浆机)，XHF-D；宁波新芝生物科技股份有限公司；全自动高压灭菌器：5Y0915，日本三洋公司；酶标仪：ELX808， Bio Tek，美国伯腾仪器有限公司；低温4℃离心机：上海第三仪器厂。

1.3 分组与造模 采用随机数字法将大鼠随机分为正常组、功能性便秘(FC)模型组、硝菔通结方低剂量组、硝菔通结方中剂量组、硝菔通结方高剂量组，每组10只。除正常组外的各组大鼠每日灌服复方地芬诺酯溶液，灌服浓度为15mg/kg，连续灌胃28d后，大鼠出现排便困难，被毛脱落，喜扎堆等现象，表示功能性便秘(FC)模型制造成功。正常组以等量生理盐水灌胃。

1.4 药物治疗 对硝菔通结方低、中、高3个剂量组每日分别灌服95g/kg、190g/kg、380g/kg的硝菔通结方；正常组和FC组每日灌服2mL/100g的生理盐水。

1.5 样本的采集与检测 给药21d后，实验动物禁食24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，开腹腔腹主静脉采血3～10mL，室温静置血液30min后离心分离出血清，按试剂盒说明书用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中5-HT的浓度；取回盲部以下结肠组织1cm，用预冷的生理盐水清洗，置于5mLEP管中，加入1mL RNAhold，匀浆，按RNA提取试剂盒提取总RNA，取2 μL总RNA按照反转录试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系：总RNA2μL，ALL-in-one SuperMix4μL、gDNA Remover1μL,加RNase-free Water定容至20μL，轻轻混匀，42℃孵育15min，85℃加热5min，测定cDNA，备用。Q-PCR法检测mRNA表达，PCR反应体系：PCR Mix 10μL，引物各0.4μL，cDNA量根据浓度定，加灭菌蒸馏水补足至20μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 S；57℃退火45S；72℃延伸40S；共40-45个循环72℃终末延伸10 min。引物序列见表1。

表1 Q-PCR引物序列

2 结 果 2.1 一般情况 正常组大鼠行动活跃、精神良好、皮毛光泽,实验后体重、食量随增龄明显高于实验前；模型组大鼠大便困难(便量少，便粒小，粪便干结，无光泽)，形体消瘦，喜扎堆，被毛脱落，纳差，造模后体重增加不明显；治疗组(硝菔通结方低、中、高剂量组)大鼠在治疗后，体重均有增加，精神状态及排便情况出现明显好转，扎堆现象消失，造模时脱落的被毛重新长出。

2.2 硝菔通结方对功能性便秘大鼠血清5-HT含量的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清5-HT含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，硝菔通结方高、中、低剂量大鼠血清5-HT浓度明显降低(P<0.05)，其中以高剂量组最为明显(P<0.01)，见表2。

表2 硝菔通结方对功能性便秘大鼠血清中5-HT含量的影响

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05，◇P<0.01

2.3 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织AQP3表达的影响 与正常组比较，模型组结肠组织中AQP3表达较正常组有显著性升高(P<0.05)；硝菔通结方各剂量可有效降低结肠组织中AQP3的表达, 其中高剂量组与模型组具有显著性(P<0.05)差异,见表3。

表3 大鼠结肠组织AQP3的表达

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

讨 论 5-HT是肠神经系统中一种重要的单胺类神经递质，由嗜铬细胞(enterochromaffin cells, EC)通过色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph-1)合成，具有促进肠蠕动和分泌的作用。5-HT释放并作用于靶细胞发挥作用后，必须重吸收至细胞内降解、灭活，终止其作用，该过程即由5-HT转运体(serotonin transporter, SERT)完成。因此，5-HT对胃肠道运动功能的调节需要5-HT、5-HT受体、SERT的共同参与才能完成[6]。研究发现[7,8]便秘患者的结肠黏膜5-HT阳性细胞数量和染色强度均以及TpH1的转录明显增加，但EC细胞的数量及SERT转录水平却无改变，因此推断黏膜内5-HT的合成和释放增加，可能是由于其受体敏感性和反应性下降，从而导致便秘[9]。本实验中便秘模型大鼠血清中5-HT含量明显高于正常组，经过硝菔通结方治疗后，5-HT含量下降至正常值，提示硝菔通结方通过改善5-HT的受体敏感性和反应性从而恢复肠神经系统对胃肠道调节的作用。

AQP3属跨膜蛋白家族，主要分布于人类小肠和结肠的上皮细胞中，其所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径，在消化道上皮细胞对水的吸收中起重要作用[10]。AQP3具体的作用机制尚不十分清楚，但临床研究发现功能性便秘患者右半结肠AQP3含量显著高于对照组[11]，且应用泻药后，结肠中AQP3的表达显著降低[5][12]。这些结果都提示AQP3可能通过将粪便中的水分转运至结肠上皮细胞，从而降低粪便含水量。AQP3表达升高引起粪便含水量降低，继而引发便秘，这可能是便秘发生的一个重要机制。本实验中便秘模型大鼠肠组织中AQP3表达显著升高，经过硝菔通结方治疗，大鼠结肠组织中AQP3表达降低，提示硝菔通结方通过降低AQP3从而调节肠道对水分的吸收，对功能性便秘发挥治疗作用。

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(收稿2014-11-10；修回2014-11-25)

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陕西医学、陕西中医杂志社

Effects of Xiaofu Tongjie Prescription on the 5-HT content in Serum and the Expression of AQP3in Colon in Constipated Rats

ShaanXi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Man Siyi Xie Pei Wang Yujin et al

Objective:To observe the effect of Xiaofu Tongjie prescription effect on the 5-HT content in serum and the mRNA expression of AQP3in colon in constipated rats, so as to reveal the mechanism of the prescription in the treatment of constipation. Methods: 50 male SD rats were randomly divided into normal control group, model group, Xiaofu Tongjie-low dose group, Xiaofu Tongjie-medium dose group and Xiaofutongjie-high dose group. Except the normal control group, the rest of the rats were intragastrically administered with 15mg/kg compound diphenoxylate for 28 days to replicate the constipation model. Then serum and colonic tissue samples were collected after 21 days of treatment. The 5-HT content in serum were detected with ELISA method and the mRNA expression of AQP3were detected with Q-PCR method.Results: The 5-HT content in serum of the model group increased significantly compared with the normal control group(P<0.05). After prescription treatment, the 5-HT level in each treatment group decreased (P<0.05),and the Xiaofu Tongjie-high dose group marked decreases (P<0.01). AQP3expression in colonic tissue of model group increases compared with the common control group (P<0.05), different dose of the Xiaofutongjie prescription groups all decrease the AQP3expression in colonic tissue, but Xiaofu Tongjie-high dose group marked ecreasesP<0.05).Conclusion:Xiaofutongjie prescription can reduce the 5-HT content in serum and decrease the mRNA expression of AQP3in colon, thus to improve the intestinal power and regulate the water metabolism of intestinal tract. Consequently, it has a great therapeutic effect on functional constipation.

Constipation unctional/integrated Chinese traditional and western medicine therapy @Xiaofu Tongjie prescription Animal，Experiment Rats

*国家自然科学基金(81273663)；国家课题重大专项(2012ZX09103201-037)

便秘，功能性/中西医结合疗法 @硝菔通结方 动物，实验 大鼠

R256.35

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.050

△通讯作者，陕西省胃肠病证方药研究室(咸阳712046)